非甾體類抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDS）為結(jié)構(gòu)中不含有甾體類結(jié)構(gòu)的一類抗炎藥物,，而阿司匹林（aspirin）更是被稱為“一大神藥”,，作為NSAIDS中的代表藥在臨床上已應(yīng)用百年有余。長(zhǎng)期積累的豐富臨床經(jīng)驗(yàn)使得人們對(duì)阿司匹林抗炎作用以外或由抗炎作用所衍生的臨床應(yīng)用有了新的拓展,。在過(guò)去30年間,，許多研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期服用阿司匹林等NSAIDS能顯著降低腫瘤發(fā)生率、延緩惡性腫瘤病程,、減少腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及降低腫瘤死亡率,。但同時(shí)，也有研究表明健康人群長(zhǎng)期服用阿司匹林或弊大于利,。阿司匹林的多靶點(diǎn)特性是導(dǎo)致阿司匹林是否能夠抗腫瘤爭(zhēng)論的原因之一,，由于阿司匹林抗腫瘤的多靶點(diǎn)性，其抗腫瘤的作用機(jī)制尚未明確闡述,。目前認(rèn)為其主要通過(guò)COX-2依賴與非依賴兩種途徑發(fā)揮作用,，以前人們趨向于將阿司匹林的抗腫瘤作用歸功于對(duì)COX-2的抑制，現(xiàn)在越來(lái)越多的證據(jù)表明阿司匹林通過(guò)COX非依賴性途徑發(fā)揮作用,。上海藥物研究所的研究人員通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)乙酰肝素酶是阿司匹林的一種相關(guān)作用蛋白,，由于乙酰肝素酶在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的促進(jìn)作用,，作者猜想阿司匹林可以通過(guò)靶向乙酰肝素酶發(fā)揮抑制腫瘤的作用,。

      文章Aspirin Inhibits Cancer Metastasis and Angiogenesis via Targeting Heparanase于2017年10月發(fā)表在Cinical Cancer Research上，IF：10.199,，通訊作者：丁健,，耿美玉,，譚敏佳， 單位：中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所

阿司匹林能夠抑制乙酰肝素酶活性

      為了確定乙酰肝素酶為腫瘤細(xì)胞內(nèi)阿司匹林的潛在靶點(diǎn),，作者使用生物素標(biāo)記的阿司匹林作為化學(xué)探針來(lái)篩選阿司匹林相關(guān)作用蛋白,，并通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)乙酰肝素酶是一種潛在的阿司匹林相關(guān)作用蛋白。通過(guò)將生物素或生物素-阿司匹林分別與MDA-MB-435和U87-HPA這兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乙酰肝素酶的腫瘤細(xì)胞裂解物共孵育,，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析,，發(fā)現(xiàn)乙酰肝素酶能夠被生物素-阿司匹林拉低，但不被生物素拉低,。并且更高濃度的未標(biāo)記阿司匹林能夠競(jìng)爭(zhēng)乙酰肝素酶與生物素-阿司匹林的結(jié)合,，表明阿司匹林能與乙酰肝素酶的特異性結(jié)合。

      通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室所儲(chǔ)備的478個(gè)臨床使用的乙酰肝素酶小分子抑制劑庫(kù)進(jìn)行篩選,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這些化合物中絕大多數(shù)對(duì)乙酰肝素酶是沒(méi)有抑制作用的,，但作者從中發(fā)現(xiàn)阿司匹林具有明顯的抑制乙酰肝素酶活性的作用。為了確證這一結(jié)果,，作者對(duì)阿司匹林抑制乙酰肝素酶酶活作用進(jìn)一步做了評(píng)價(jià),，結(jié)果顯示，隨著濃度的增加阿司匹林能夠劑量依賴性地抑制乙酰肝素酶酶活作用,。同時(shí),，作者使用不同濃度的阿司匹林分別對(duì)四種腫瘤細(xì)胞(B16F10、CHO-K1,、MDA-MB-435,、U87-MG)進(jìn)行處理后通過(guò)HTRF檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)阿司匹林能夠劑量依賴性抑制這些癌細(xì)胞中乙酰肝素酶的活性,。

      那么阿司匹林是通過(guò)與乙酰肝素酶的什么部位相結(jié)合起到抑制乙酰肝素酶活性的作用呢?由于底物競(jìng)爭(zhēng)是小分子抑制劑抑制乙酰肝素酶活性的常見(jiàn)機(jī)制,。作者首先使用了表面等離子體共振法(SPR)測(cè)試阿司匹林是否能夠與乙酰肝素酶的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合。通過(guò)對(duì)已知介導(dǎo)肝素和硫酸乙酰肝素與乙酰肝素酶結(jié)合的三個(gè)結(jié)構(gòu)域(KKDC,，QPLK,，KKLR)進(jìn)行測(cè)試，并沒(méi)有觀察到阿司匹林與這些結(jié)構(gòu)域中的任何一個(gè)結(jié)合,，表明阿司匹林可能與非肝素結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,。

      于是作者使用人類乙酰肝素酶的同源模型進(jìn)行分子對(duì)接，探索阿司匹林與乙酰肝素酶可能的結(jié)合位點(diǎn),。通過(guò)比較阿司匹林,、生物素-阿司匹林以及水楊酸(阿司匹林在細(xì)胞內(nèi)的主要水解產(chǎn)物)與乙酰肝素酶的結(jié)合模式，并使用點(diǎn)突變的方式進(jìn)行驗(yàn)證,，發(fā)現(xiàn)了乙酰肝素酶Glu225,，Lys231，Gln157和Lys159區(qū)域在這些相互作用中的重要作用,。進(jìn)一步驗(yàn)證這些點(diǎn)突變對(duì)乙酰肝素酶活性的影響,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Glu225是唯一一個(gè)能夠?qū)е乱阴８嗡孛甘Щ畹膮^(qū)域,。由此，作者猜測(cè),，阿司匹林可能通過(guò)直接與乙酰肝素酶的Glu225區(qū)域結(jié)合以抑制乙酰肝素酶的活性,。

阿司匹林對(duì)乙酰肝素酶引起的腫瘤轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成起抑制作用

      由于乙酰肝素酶與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)，作者使用transwell小室來(lái)測(cè)試阿司匹林對(duì)乙酰肝素酶所促進(jìn)的腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響,。用阿司匹林處理乙酰肝素酶高表達(dá)的B16F10和MDA-MB-435細(xì)胞,，結(jié)果顯示，阿司匹林能劑量依賴性地抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲,。

      而在乙酰肝素酶高表達(dá)或敲低的情況下,，阿司匹林抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的作用被明顯削弱。同時(shí),，外源性加入乙酰肝素酶能夠逆轉(zhuǎn)由阿司匹林引起的細(xì)胞受損,。考慮到阿司匹林具有COX依賴性抗腫瘤活性,，作者使用siRNA來(lái)敲低COX探索阿司匹林作用是否受到影響,，結(jié)果顯示，無(wú)論敲低COX-1或COX-2的表達(dá),，阿司匹林都能夠顯著抑制MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同表明阿司匹林在抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲中的乙酰肝素酶依賴性作用。

      乙酰肝素酶能夠促進(jìn)釋放VEGF和其他硫酸乙酰肝素結(jié)合的血管生成生長(zhǎng)因子,，加速促血管生成因子驅(qū)動(dòng)的血管生成,。因此，作者檢查了阿司匹林對(duì)腫瘤細(xì)胞中VEGF釋放的影響,。通過(guò)ELISA測(cè)量分泌到癌細(xì)胞培養(yǎng)基中的VEGF水平,，結(jié)果顯示，阿司匹林治療后顯著抑制了MDA-MB-435和U87-MG細(xì)胞中VEGF的釋放,。而CHO細(xì)胞中的乙酰肝素酶過(guò)表達(dá)或MDA-MB-435細(xì)胞中的沉默逆轉(zhuǎn)了阿司匹林的作用,。在8小時(shí)經(jīng)血清刺激后HUVEC細(xì)胞能夠在基質(zhì)膠上形成完整的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而阿司匹林治療后,，血管形成受到劑量依賴性抑制,。同樣，即使存在COX抑制劑塞來(lái)昔布或羅非考昔,，阿司匹林也可抑制小管形成,。

      作者使用大鼠主動(dòng)脈芽生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了阿司匹林的抗血管生成作用，大鼠主動(dòng)脈芽生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)概括了血管生成過(guò)程中的幾個(gè)關(guān)鍵步驟,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4mM的阿司匹林能夠完全抑制大鼠主動(dòng)脈芽的生長(zhǎng),。此外，作者還使用雞胚絨毛尿囊膜模型測(cè)定(CAM)檢查了阿司匹林對(duì)新血管形成過(guò)程的影響，類似的,，與未處理的對(duì)照相比，當(dāng)用阿司匹林處理時(shí),，雞胚中的新血管形成被顯著抑制,。所有這些結(jié)果表明阿司匹林在體外和離體實(shí)驗(yàn)中具有靶向乙酰肝素酶抗血管生成潛力。

阿司匹林對(duì)乙酰肝素酶體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)評(píng)價(jià)

      以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明體外阿司匹林的乙酰肝素酶依賴性抗轉(zhuǎn)移和抗血管生成活性,。作者進(jìn)一步證實(shí)了體內(nèi)效應(yīng),。分別使用鼠B16F10實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型及MDA-MB-231肺轉(zhuǎn)移模型評(píng)估阿司匹林的抗轉(zhuǎn)移潛力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這兩種模型中阿司匹林都可以降低腫瘤轉(zhuǎn)移數(shù)量并抑制體內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生率,。作者還通過(guò)在裸鼠皮下注射人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞來(lái)檢查阿司匹林在乙酰肝素酶相關(guān)異種移植模型中的抗血管生成活性,，并對(duì)血管生成進(jìn)行評(píng)估。給藥20天后,，在阿司匹林治療組中觀察到腫瘤生長(zhǎng)受到抑制,，阿司匹林處理組顯示CD31陽(yáng)性微血管相對(duì)于對(duì)照顯著減少，同時(shí),，腫瘤內(nèi)乙酰肝素酶關(guān)鍵的下游信號(hào)分子的磷酸化現(xiàn)象也被明顯抑制,。至此，作者在體內(nèi)動(dòng)物模型中證實(shí)了阿司匹林靶向乙酰肝素酶抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成的作用,。

      以阿司匹林為代表的非甾體類抗炎藥抗腫瘤作用已被社會(huì)廣泛認(rèn)知,，但是其作用機(jī)制仍存爭(zhēng)議。目前已報(bào)道阿司匹林除去環(huán)氧合酶COX外還具有大量的分子靶點(diǎn)：如激活A(yù)MPK,、靶向mTOR等,。本文研究中，作者將乙酰肝素酶確定為阿司匹林的潛在靶點(diǎn)之一,，并證明了乙酰肝素酶相關(guān)的抗癌活性,，特別是抗轉(zhuǎn)移和抗血管生成活性。

      乙酰肝素酶導(dǎo)致硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)降解,，并引發(fā)硫酸乙酰肝素(HS)鏈結(jié)合血管生成因子如VEGF,，HGF和bFGF等的釋放，導(dǎo)致對(duì)于血管生成有利的腫瘤微環(huán)境的形成,。本研究采用HTRF篩選平臺(tái)證實(shí)了阿司匹林具有抑制乙酰肝素酶活性的作用,，乙酰肝素酶為其靶點(diǎn)之一。通過(guò)免疫共沉淀結(jié)合冷探針實(shí)驗(yàn)證明了阿司匹林與乙酰肝素酶能夠直接結(jié)合,，并通過(guò)SPR和分子對(duì)接證明阿司匹林可能通過(guò)結(jié)合于乙酰肝素酶的Glu225活性區(qū)域,，而非肝素結(jié)合區(qū)，進(jìn)而發(fā)揮乙酰肝素酶酶活抑制作用,。

      研究證實(shí)了阿司匹林作為乙酰肝素酶抑制劑,，能夠抑制乙酰肝素酶誘發(fā)的相關(guān)效應(yīng)：腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲、VEGF的釋放,、血管新生以及信號(hào)通路的活化,。為更好地了解阿司匹林在抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用中的作用機(jī)制提供了新的見(jiàn)解,，為開(kāi)發(fā)小分子乙酰肝素酶抑制劑提供了新的方向。