今天我們繼續(xù)來聊一聊ImageJ的高階使用技巧,。

問題三、為什么總是全部圈起來的灰度值,，有沒有大神指導(dǎo)呢求助,！

本問題涉及免疫印跡（Western Blot）分析，提問者不能分別得到每個條帶的值,。

灰度值0為純黑,，255為純白，灰度值與光密度值（OD值）的關(guān)系如下圖所示：

以灰度來統(tǒng)計WB條帶的話,，無條帶的純白255左右,，條帶越黑著色越深灰度值反而越小，這與我們的認(rèn)知不符,。

步驟：

1. File -> Open -> 打開需要分析的WB條帶,。

2. Image –> Type -> 8-bit, 將圖像轉(zhuǎn)換為8-bit的灰度圖片；Image-> Invert,，黑白反轉(zhuǎn),，得到如下圖片：

3. Analyze -> Calibrate, 校正光密度值Function中選擇Uncalibrated OD，左下方Global calibration，勾選表示有多張圖片打開時對所有圖片進(jìn)行此操作,。否則只對當(dāng)前圖片進(jìn)行此操作,。

4. 在工具欄中選擇矩形工具——Rectangular, 最左邊的為矩形工具，選擇條帶：

鍵盤上按數(shù)字1,，彈出如下提示框：

點(diǎn)Yes,，鍵盤上按數(shù)字3，得到如下：

5.  工具欄中選擇直線工具——Straight，下圖最右邊的為直線工具,，按住Shift鍵使用直線工具畫豎線將步驟4的峰進(jìn)行分割：

6.  選擇魔棒工具——Wand tool,，分別點(diǎn)擊分割好的峰，即可得到結(jié)果,，保存結(jié)果（File -> Save as…）即可：

7. WB統(tǒng)計分析一般將對照組標(biāo)準(zhǔn)化為100%或1，上述結(jié)果6個條帶前3個為對照組,。在Excel中,，先計算對照組3個的平均值（AVERAGE(B2:B4)）：

然后所有B列的數(shù)值除以對照組平均值，此時對照組的均值為1：

8. 將所得數(shù)據(jù)放入Graphpad prism繪圖即可：

拓展：

彎曲的WB條帶應(yīng)如何使用ImageJ拉直,？

1. 使用Segmented line沿著傾斜條帶畫間斷線段：

2.  雙擊Segmented line,，設(shè)置線段的寬度至包含所有條帶：

3. 點(diǎn)擊菜單欄Edit -> Selection-> Straighten，傾斜的WB條帶即可拉直：

問題四,、如何統(tǒng)計SEM圖片小球數(shù)量,？

步驟：

1. 打開ImageJ軟件，F(xiàn)ile -> Open打開SEM圖片,。Image -> Type將圖片調(diào)整為8-bit,。

2. Process -> Enhance Contrast，選擇Normalize,，點(diǎn)擊OK：

3. Process -> Find Maxiam,，根據(jù)Preview point selection查看Noise tolerance參數(shù)的效果，Output type 選擇Count可得到計數(shù)數(shù)據(jù)：

得到結(jié)果共有343個小球：

問題五,、怎樣用image J一鍵輸出這張圖上所有的葉片面積,，并且是編號的？

步驟：

1. ImageJ軟件打開葉子圖片,，Image Type將圖片調(diào)整為8-bit,。

2. Image -> Adjust -> Threshold 調(diào)節(jié)閾值，紅色代表選中,，使所有葉子均被選中,，葉子閾值為0-123。

3. 使用魔棒選中一片看起來最小的葉子,，以此來評估葉子的大小范圍,。Analyze ->Measure進(jìn)行測量：

4. Analyze -> Analyze particles,。

Size(pixel^2): 默認(rèn)為0-Infinity（無窮大），意思是需要計算的細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞大小在哪個區(qū)間,，比如在此葉子大小選擇為 20000-Infinity,，將不是計數(shù)目標(biāo)的雜質(zhì)點(diǎn)過濾掉，在此我們需要根據(jù)目的細(xì)胞的大小來試幾個最小值就能得到準(zhǔn)確的細(xì)胞計數(shù)結(jié)果,。

點(diǎn)擊OK,，得到每片葉子的編號、輪廓與面積：

拓展1：

上述得到的Area單位為pixel^2,，如何得到其實(shí)際面積,？

在未校準(zhǔn)標(biāo)尺的情況下，ImageJ打開的圖片為像素（px）,，標(biāo)尺反應(yīng)的是圖片像素與實(shí)際長度的比例關(guān)系：

葉子的照片需要在拍照時放置一個已知長度的尺子——標(biāo)尺,。

ImageJ添加標(biāo)尺步驟如下：

1. ImageJ軟件打開含有標(biāo)尺的葉子圖片：

2. 使用直線工具按住Shift沿著標(biāo)尺畫一條直線：

3. Analyze -> Set Scale：

直線的距離為31pixels，在Known distance（已知距離）填入1cm,，Unit of length為cm,，Global對所有后續(xù)打開圖片有效，否則只對當(dāng)前圖片有效,，點(diǎn)擊OK,。此時葉子圖片標(biāo)尺為：

4. 后續(xù)分析葉子面積與前述步驟一致，此時得到的面積單位為cm^2：

拓展2：

如何得到一組葉子的平均面積,、標(biāo)準(zhǔn)差信息,？

在得到同一圖片內(nèi)數(shù)張葉子面積后，Results ->Distribution,，選擇Area：

得到分布結(jié)果：

總共有5個面積，Mean為2.928,，StdDev為1.574,，Min為0.938，最大值為4.655……,。

當(dāng)然,，Results ->Summarize也可以得到上述信息：

今天給大家分享ImageJ的使用就到此為止，希望對大家有所幫助,！