N6-腺苷酸甲基化（m6A）是真核生物mRNA的最普遍的內部修飾,，研究表明在人和小鼠中大概有三分之一的mRNA存在m6A修飾,。m6A可調控RNA的編輯、翻譯和降解,，影響mRNA的穩(wěn)定性,、調節(jié)蛋白質與RNA的相互作用，廣泛參與了哺乳動物的發(fā)育,、免疫,、腫瘤生成與轉移、干細胞分化等生命過程,。

既然m6A可調控基因的翻譯,，那么是否可以聯(lián)合翻譯組技術與m6A檢測技術來研究呢？答案當然是可以的,。今天我們就來解讀一篇Nature Medicine的文章,，看看大神們是如何聯(lián)合這兩個組學進行翻譯調控的研究的。

發(fā)表雜志：Nature Medicine

影響因子：32.621

N6-腺苷酸甲基化（m6A）是真核生物mRNA的最普遍的內部修飾,，可調控RNA的編輯,、翻譯和降解，在細胞分化和組織發(fā)育中起著重要的作用,。已知m6A在小鼠胚胎干細胞的分化中是必需的,，但m6A是否調控正常或惡性骨髓造血細胞的分化還不清楚。因此本文研究m6A甲基化轉移酶METTL3對白血病細胞分化的影響,。

與m6A修飾相關的三種酶：

Writers: 即甲基化轉移酶,，將甲基化修飾“寫入”RNA，介導RNA的甲基化修飾過程,；

Erasers: 即去甲基化酶,，將RNA甲基化修飾信號“擦除”，介導RNA的去甲基化修飾過程,；

Readers：甲基化識別蛋白,，“讀取”RNA甲基化修飾的信號，參與下游RNA的翻譯,、降解等過程,。

1. m6A在造血干細胞HSCs中的作用

利用shRNA敲除人造血祖細胞（HSPCs）中的m6A RNA甲基轉移酶METTL3，細胞中總體m6A修飾水平顯著下降,，并且促進了細胞分化,，同時減緩了細胞增殖。細胞中過表達METTL3則抑制了細胞分化和促進了細胞增殖（圖1）,。

圖1 m6A抑制了HSPCs的骨髓細胞分化

2. METTL3在白血病細胞中的表達變化

由于白血病的骨髓細胞分化經(jīng)常發(fā)生變化,，因此檢測METTL3在白血病細胞中的表達水平是否發(fā)生變化。結果表明,，METTL3的mRNA轉錄本和相應表達蛋白的表達量在急性髓系白血病細胞（AML）中要比健康HSPCs或其他類型腫瘤細胞要高（圖2a,b）,，而且mRNA的m6A修飾水平在AML細胞中顯著高于正常對照細胞（圖2c）。說明m6A修飾的提高對于維持白血病細胞的不分化狀態(tài)是非常重要的,。敲除METTL3后可促進人白血病細胞MOLM-13的分化和凋亡,，并在小鼠體內延緩白血病的進程（圖2h）。

圖2 m6A促進白血病生成

3. m6A調控c-MYC, BCL2, PTEN基因的翻譯表達

單堿基分辨率miCLIP,、RNA-seq和核糖體印跡技術結果發(fā)現(xiàn),，發(fā)生m6A修飾的mRNA轉錄本在METTL3敲除細胞系MOLM-13中表達量上調，但這些mRNA的翻譯效率卻下降（圖3）,。

對三個組學的結果進行基因集富集分析（GSEA）,，共鑒定出44個Gene set交集，這些gene set所包含的基因是發(fā)生m6A修飾的,、敲除METTL3后mRNA轉錄本表達量上調但翻譯效率下降的,。這些基因涉及到凋亡、分化,，以及MYC相關基因,，比如c-MYC, BCL2, PTEN基因，它們含有數(shù)目最多的m6A修飾位點,。

MeRIP-qPCR,、western blot等實驗結果顯示,，敲除METTL3后降低了c-MYC, BCL2, PTEN基因的m6A修飾水平，并且相應蛋白表達量下降（圖4）,。過表達野生型METTL3導致了c-MYC, BCL2, PTEN蛋白的表達量增加,，而過表達METTL3的非酶活突變型則不影響這些基因編碼蛋白的表達量變化。這些結果表明m6A可促進人急性髓系白血病MOLM-13細胞系中c-MYC, BCL2, PTEN等基因mRNA的翻譯,。

圖3 m6A維持靶標mRNA的翻譯表達

圖4 m6A調控c-MYC,BCL2, PTEN基因的表達

4. METTL3影響細胞分化的機制研究

利用反相蛋白芯片（RPPA）技術研究METTL3影響的信號通路,。結果顯示，敲除METTL3后提高了磷酸化AKT的表達水平（圖5）,，這表明m6A修飾去除后可激活PI3K/AKT信號通路，從而促進了細胞分化,。PTEN基因編碼了一個p-AKT的負調控因子,，綜合以上結果，表明p-AKT表達量的提高是由于PTEN基因的翻譯效率降低所致,。

圖5 METTL3敲除細胞MOLM-13中的蛋白表達量熱圖

這些結果表明m6A修飾在造血干細胞分化中起著非常重要的作用,，而白血病細胞通過轉錄本的m6A修飾來調控特定基因的翻譯，從而影響了細胞的分化和凋亡,。這些結果表明METTL3可以作為白血病臨床治療的一個靶基因位點,。