近年研究表明,，白血病的發(fā)生與細胞原癌基因的激活和抑癌基因的缺失或突變有著密切的關(guān)系。其中原癌基因c-myc是目前研究最為廣泛的癌基因之一,，其基因擴增和過度表達,，可促進細胞增殖、抑制細胞分化,。在某些因素引起細胞增殖停滯時，c-myc基因的持續(xù)表達還可促進細胞凋亡,。并且發(fā)現(xiàn)c-myc在白血病中高度表達與白血病的發(fā)生,、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。筆者就c-myc基因的結(jié)構(gòu),、功能及其在白血病中的表達與意義作一綜述,。
1.c-myc基因的結(jié)構(gòu)和功能
　　myc基因家族成員有3個：cell-myc(c-myc)、human-myc(N-myc)和myc-related-gene(L-myc),。它們具有類似的結(jié)構(gòu)和功能,。人類c-myc原癌基因定位于8q24區(qū)，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成,。第1外顯子無編碼序列,，是轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，只起調(diào)節(jié)作用,。外顯子2和3是轉(zhuǎn)譯區(qū),，編碼包含439個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，分子量為49
kD,。外顯子1,2,3共同編碼分子量為65 kD的蛋白質(zhì),，定位于核內(nèi)，為核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,。該蛋白質(zhì)位于N端143個氨基酸區(qū)域富含脯氨酸,、谷氨酸殘基,，為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(transcription
activation domain，TAD),；第320-328氨基酸處含有將胞質(zhì)中合成的Myc蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運至核內(nèi)的信息,，為核定位區(qū)；位于C端355～439位氨基酸,，包含有形成二聚體的特征性結(jié)構(gòu),，為二聚體形成結(jié)構(gòu)域:包括堿性結(jié)構(gòu)域(B)，螺旋一回轉(zhuǎn)一螺旋結(jié)構(gòu)域(HLH)及亮氨酸拉鏈區(qū)(LZP),。C-myc蛋白通常和細胞內(nèi)其他蛋白質(zhì)結(jié)合,，其中最主要的是具有BHLHLZ結(jié)構(gòu)的蛋白MAX。C-myc和MAX形成MYC-MAX異二聚體,，在核內(nèi)通過和具有CACGTG核心序列的靶基因結(jié)合,，反式激活靶基因的轉(zhuǎn)錄［1］，從而發(fā)揮c-myc作用,。
　　近年發(fā)現(xiàn)的具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白MAD1和MAD2(MXIL1)也能和MAX形成異二聚體［2］,，競爭MAX與MYC的結(jié)合，對MYC-MAX異二聚體具有拮抗作用,，從而調(diào)節(jié)MYC的功能［3］,。
2.c-myc在造血細胞發(fā)育及白血病發(fā)生中的作用
　　c-myc原癌基因編碼的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物C-myc蛋白與細胞周期密切相關(guān)，參與DNA聚合酶的活性,，并調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化［4］,。在正常細胞的靜止?fàn)顟B(tài)和終末分化后，C-myc表達受抑,，mRNA水平降低,；正常細胞增殖時，C-myc表達一過性激活,，并在蛋白質(zhì)合成開始前受到抑制,。如正常人淋巴細胞和成纖維細胞在受到ConA、LPS,、PHA及PDGF等絲裂原刺激后,，c-myc的mRNA水平迅速升高20～40倍，并在1～3
h內(nèi)達到高峰,，然后下降,，1～2天后降至原來基線水平［5］。c-myc只是在正常細胞的增殖早期發(fā)揮著一定生理作用,，使細胞從G0期或G1期進入S期［6］,。研究表明，鼠MEL,，HL60,，U937等細胞株的體外分化過程中伴隨著C-myc表達下降［4～6］,。類似的研究也說明C-myc的表達與造血細胞的分化成負相關(guān)。當(dāng)HL60細胞受誘導(dǎo)分化劑作用向成熟粒細胞或單核細胞分化時,，C-myc的表達減弱［7］,。
　　c-myc基因以重排，擴增與高表達方式,，使C-myc蛋白異常升高,。在白血病的發(fā)生中,，其異常表達與其他調(diào)控機制及多種癌基因協(xié)同作用下,，通過促進DNA合成與轉(zhuǎn)錄,，縮短細胞倍增時間，同時抑制細胞分化,，促進細胞增殖,，最終導(dǎo)致白血病的發(fā)生。
　　C-myc表達和白血病發(fā)生有關(guān),，因為(1)C-myc表達與白血病預(yù)后有關(guān),；(2)白血病復(fù)發(fā)時C-myc表達增高；(3)CML急變時C-myc高表達,。用反義技術(shù)也證明這一點,。1988年Wickstrom［8］和Holt［9］分別合成15個堿基長度的c-myc
mRNA的反義寡聚脫氧核苷酸ASODN在體外與HL60細胞共培養(yǎng)后，有效地抑制c-myc的表達,，細胞生長受到抑制,，同時抑制白血病細胞集落的形成。研究認為c-myc反義核酸對白血病細胞生長的抑制是通過抑制c-myc基因表達實現(xiàn)的,，同時也表明c-myc基因在白血病發(fā)生中起重要的作用。
3.c-myc基因在白血病中的表達及其在檢測殘留白血病中的意義
　　c-myc原癌基因在多種人類腫瘤細胞中均有擴增和高表達,。1982年Collins等［10］首次報道了HL60細胞株和早幼粒細胞白血病病人的白血病細胞中c-myc基因高表達,。Gopal等［11］研究進一步表明，急性淋巴細胞白血病和急性非淋巴細胞白血病C-myc表達最強,，慢粒(CML),、骨髓增殖異常綜合癥(MDS)和多發(fā)性骨髓瘤（MM）C-myc蛋白表達遠低于急性白血病，但明顯高于正常對照,，淋巴瘤的C-myc表達最低,，可能是由于瘤細胞很少累及骨髓所致。C-myc的異常表達與急性白血病的FAB分型無相關(guān)性,，但c-myc
mRNA和蛋白表達水平的檢測對白血病的病程演進,，療效評價和預(yù)后估計均有一定意義［12］。Venturelli等［13］發(fā)現(xiàn)化療有效的白血病患者在化療開始24
h后c-myc mRNA水平就明顯降低,，若化療無效或不緩解?？蓹z測到c-myc mRNA和蛋白表達呈持續(xù)高水平,。緩解后復(fù)發(fā)的患者在未出現(xiàn)其他臨床征象之前就可查到骨髓中有C-myc的高水平表達。Harvey等［12］應(yīng)用Northern
Blot分析急非淋白血病患者化療前后骨髓中c-myc mRNA水平變化的研究中發(fā)現(xiàn)白血病細胞c-myc
mRNA高表達的患者很難在化療藥物的誘導(dǎo)下達到完全緩解,，即使已誘導(dǎo)緩解,，其緩解期也明顯短暫，反之c-myc表達水平越低,，患者的完全緩解率越高,，無病生存期也越長。慢粒慢性期患者骨髓或外周血中c-myc高表達常預(yù)示病情將向急變期發(fā)展,。Evinger-Hodges等［14］用myc探針在10例白血病短期緩解的病人中檢測到7例有c-myc高表達,，其中5例在半年內(nèi)復(fù)發(fā)，而長期存活者(緩解期14～78個月)均無c-myc的高表達,。這可能是由于C-myc高水平表達與白血病細胞自我更新能力提高和/或?qū)煼磻?yīng)誘導(dǎo)分化不敏感有關(guān)所致,。這些研究結(jié)果均表明，檢測白血病c-myc基因的表達水平是反映白血病細胞惡性程度判斷預(yù)后的重要指標(biāo)之一,。
　　c-myc幾乎在各型的白血病中均有表達,，在單個白血病原始細胞中c-myc基因表達量顯著高于分化水平與之一致的正常骨髓細胞，故c-myc探針也可作為檢測殘留白血病的特異性指標(biāo),。
　　急性白血病化療和骨髓移植中最主要的問題是不能明確完全緩解期和骨髓移植后白血病細胞被殺傷的程度以及殘留白血病細胞的量,。組化檢測的限度為1%-5%。PCR技術(shù)已被用來檢測殘留白血病細胞,。雖然PCR的檢出率為10-4～10-5,，但只能用來檢測那些腫瘤特異性基因標(biāo)記，如慢粒bcr/abl基因及M3
PML/RARα基因,，應(yīng)用范圍窄,。由于c-myc在各種類型白血病中的表達均增加，用RT-PCR法定量檢測c-myc的表達以檢測微小殘留病變（MRD）,，幾乎可用于各種類型的白血病,，對早期預(yù)測復(fù)發(fā)及判定預(yù)后、制定個體化療方案有一定的臨床意義,。
4.C-myc與白血病細胞凋亡
　　C-myc蛋白既可推進細胞周期,，促進細胞增殖，抑制細胞分化,，又可介導(dǎo)細胞凋亡PCD的發(fā)生,。Freytag等［15］研究發(fā)現(xiàn)C-myc蛋白的增殖功能和凋亡功能有密切關(guān)系。C-myc蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),，DNA結(jié)合異二聚體形成的功能區(qū)都是它發(fā)揮凋亡功能所必須的,，因此C-myc對于凋亡和增殖調(diào)節(jié)的基本機制是一致的［15］。Evan［16］報道,，用小鼠IL-3依賴性髓細胞（32D）進行培養(yǎng),，發(fā)現(xiàn)去除IL-3后,，c-myc基因立即下調(diào)，結(jié)果細胞停止于G1期,。將攜帶c-myc基因的載體轉(zhuǎn)染32D細胞,，獲得穩(wěn)定表達c-myc基因的32D細胞克隆。這種細胞去除IL-3后不停止于G1期,，而是啟動凋亡,。這個實驗說明一旦細胞增殖停滯，c-myc基因會啟動凋亡,。為什么c-myc基因既可促進細胞增殖,，同時又可促進凋亡呢？目前認為由于C-myc蛋白中促進細胞凋亡與促進細胞增殖的功能區(qū)是同一個區(qū),，C-myc的表達只提供一個啟動細胞增殖或凋亡的信號,，需有第二個生長信號刺激后才能抑制細胞凋亡，促進細胞進入增殖狀態(tài),，若沒有第二個信號則自動進入凋亡,。C-myc起介導(dǎo)凋亡的作用，可能主要影響凋亡的啟動,。C-myc先和MAX結(jié)合成異二聚體MYC-MAX,，再經(jīng)MYC-MAX和DNA結(jié)合通過控制誘導(dǎo)凋亡所需要的轉(zhuǎn)錄而對C-myc誘導(dǎo)的細胞凋亡進行調(diào)控［17］。近年來,，許多學(xué)者報告C-myc能直接或間接地誘導(dǎo)或抑制多種基因的表達,。其中，受C-myc抑制的基因包括Ⅱ類MHC,、膠原,、LFA-1α、細胞周期蛋白D1和c/EBPα以及C-myc自身等,。C-myc也誘導(dǎo)多種基因表達如鳥氨酸脫羧酶（ODC）,、α-prothymosin、ECA39,、elF4E、elF2α,、細胞周期蛋白A和E,、hsp70以及乳酸脫氫酶(LDH)等。關(guān)于這些靶基因在C-myc誘導(dǎo)細胞凋亡中的作用已有廣泛研究,。例如,，像C-myc基因一樣，ODC基因高表達足以誘導(dǎo)凋亡,。使用ODC活性抑制劑DFMO可抑制C-myc誘導(dǎo)細胞凋亡的活性,。但是ODC誘導(dǎo)凋亡的作用沒有C-myc大,，DFMO也只是部分地抑制C-myc誘導(dǎo)凋亡的作用［18］。研究還發(fā)現(xiàn),，C-myc誘導(dǎo)的成纖維細胞凋亡需要P53,并且和P53的穩(wěn)定性有關(guān),。然而，這種效應(yīng)可能具有細胞特異性,。此外,，C-myc誘導(dǎo)的細胞凋亡可被抗氧化劑和Bcl-2抑制，而且Bcl-2也具有抗氧化特性,。因而推測,，ROS(活性氧)或某些活性氧產(chǎn)物增加可能導(dǎo)致凋亡發(fā)生。
　　1992年Evan等［16］發(fā)現(xiàn)以不同方式在細胞周期的不同階段急劇降低鼠細胞中的myc蛋白的水平會誘導(dǎo)細胞凋亡,。在低血清培養(yǎng)條件下培養(yǎng)表達不同水平的myc蛋白的細胞亞克隆,，發(fā)現(xiàn)myc蛋白的含量越高對低血清培養(yǎng)越敏感，出現(xiàn)細胞凋亡早,，程度也嚴重,。低血清培養(yǎng)中有絲分裂因子減少，可使細胞的C-myc表達降低,。因此推論急劇降低C-myc水平可導(dǎo)致C-myc高表達的腫瘤細胞進入凋亡,，而對C-myc表達量很低的正常細胞則不產(chǎn)生明顯的影響。1995年Kimura等［19］發(fā)現(xiàn)應(yīng)用反義核酸持續(xù)抑制C-myc的表達能誘導(dǎo)HL60細胞的凋亡,，去除c-myc反義核酸后,，c-myc表達上調(diào)，凋亡細胞數(shù)由原來的3.5%上升至32%,。Thompson等［20］類似研究應(yīng)用糖皮質(zhì)激素處理淋巴瘤細胞使得瘤細胞的C-myc轉(zhuǎn)錄快速下調(diào)而引起凋亡,。以上研究表明細胞的凋亡是由于C-myc蛋白的不當(dāng)表達所引起，在c-myc基因表達發(fā)生急劇變化時可誘導(dǎo)細胞凋亡,。
5.c-myc反義技術(shù)在白血病基因治療中的應(yīng)用
　　c-myc基因做為靶基因,，是反義技術(shù)用于抑制癌基因表達研究最早也是最多的癌基因。包括反義DNA,，反義RNA,，Ribozyme及三股螺旋DNA-Triplex等。
5.1　反義DNA　80年代末期Heikkila等［21］首先合成了人c-myc基因的反義核酸,，作用于人T淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)AS-ODN可抑制PHA刺激的T細胞C-myc蛋白表達,，同時阻止細胞進入S期,。其后Wickstrom和Holt等［8，9］分別用人工合成的與c-myc第二外顯子起始轉(zhuǎn)錄序列互補的15
mer AS-ODN阻斷人早幼粒細胞性白血病細胞株HL60中c-myc原癌基因的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它能抑制瘤細胞的增殖,，并誘導(dǎo)終末分化,，且其作用效應(yīng)與其作用濃度存在一定的相關(guān)性。1995年Kimura［19］等類似研究報道亦證實了上述現(xiàn)象,，并且發(fā)現(xiàn)c-myc
AS-ODN持續(xù)抑制c-myc的表達能誘導(dǎo)HL60細胞凋亡,，而一旦撤去這種抑制，卻能誘導(dǎo)更多的HL60細胞進入凋亡,。
5.2　反義RNA　80年代末,，Lachman［22］等將鼠的myc cDNA片段(1.36
kb，含c-myc編碼序列及5'端,，3'端非編碼序列)以順式和反式方向克隆入鼠MT-1基因啟動子下游,，構(gòu)建了重組質(zhì)粒PMT-myc，并轉(zhuǎn)染入鼠紅白血病細胞株MEL,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由反式插入的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MEL細胞c-myc
mRNA表達被阻斷,，細胞向終末分化。日本學(xué)者Yokoyama等［23］將c-myc反義核酸的重組質(zhì)粒用原生質(zhì)體融合方法轉(zhuǎn)入HL60細胞,，觀察到6個月內(nèi)HL60可表達高水平反義c-myc,，HL60細胞生長抑制，向單核細胞終末分化,，c-myc基因轉(zhuǎn)錄抑制,，且C-myc蛋白表達水平降低70％以上。
5.3　三股螺旋　當(dāng)反義核酸堿基進入雙鏈DNA后與其形成穩(wěn)定的不可逆的三維螺旋結(jié)構(gòu),，競爭抑制激活轉(zhuǎn)錄的蛋白與基因啟動子結(jié)合,，干擾基因的轉(zhuǎn)錄。Cooney等［24］在體外實驗中通過三維螺旋體的方法抑制了c-myc的轉(zhuǎn)錄,。
5.4　核酶　核酶是具有催化活性的RNA分子,，能序列特異地切割靶RNA。核酶通過兩側(cè)的引導(dǎo)序列與底物以堿基互補形成雜交鏈,，具有更高的底物特異性,。核酶切割完靶RNA后即從雜交鏈上解離下來，對新的靶RNA進行切割,。核酶技術(shù)已成為近年來基因治療的一種新方法,，欒榮華等［25］根據(jù)c-myc癌基因第二外顯子作為核酶的靶RNA區(qū)設(shè)計能特異性地切割大鼠c-myc癌基因mRNA的錘頭狀核酶，在理論上具有一定的生物活性,。
　　Skorski等［26］體外單用或同時使用BCR/ABL和c-myc反義核酸處理CML原始細胞,，結(jié)果表明同時使用BCR/ABL和c-myc反義核酸引起基因表達下調(diào)，抗CML細胞增殖作用明顯強于各自單獨使用,，而對正常骨髓克隆的形成無影響。將BCR/ABL和/或c-myc反義核酸處理過的CML原始細胞注射入SCID小鼠，用流式細胞儀,、RT-PCR等技術(shù)分析鼠組織細胞懸液的白血病細胞,，發(fā)現(xiàn)兩種反義核酸同時處理的小鼠病程延緩，生存期延長,，效果比單用者明顯,。葛樂等通過c-myc和/或bcl-2基因的反義核酸對HL60和原代白血病細胞的影響研究也發(fā)現(xiàn)針對多癌基因反義核酸在逆轉(zhuǎn)白血病細胞惡性表型，抑制癌細胞惡性生長方面表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng),。因此,，我們認為，針對多個有協(xié)同作用癌基因的多種反義核酸同時應(yīng)用,，在ABMT體外凈化和白血病治療中具有廣闊的前景,。
卓光生，陳志哲（審校）
作者簡介:陳　琳(1970～),，女,，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士.
作者單位:陳琳(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院,，福建省血液病研究所,，福州　350001)
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