錢　淵

呼吸道感染是兒科最常見的疾病之一，臨床表現(xiàn)多樣,，嚴重者可致死亡,。病毒是最常見的致病原之一,，尤其對于小嬰兒。敏感,、特異,、快速的病原診斷是正確診治的重要保證。近年來,，新的病毒病原診斷方法不斷涌現(xiàn),，該文就各種診斷技術和方法的優(yōu)缺點和臨床實際應用價值做一闡述。

呼吸道感染,；病毒,；兒童；病原診斷

急性呼吸道疾病是影響人類健康的常見病,、多發(fā)病。病毒感染常常是這些疾病的直接病因或激發(fā)因素,，對于兒童（尤其是嬰幼兒）更是如此,。兒童呼吸道病毒感染的臨床表現(xiàn)多樣，從輕微的,、自限性的上呼吸道感染到嚴重的甚至是致死性的下呼吸道感染,，季節(jié)性明顯，往往會在短時間內(nèi)引起門,、 急診患兒的突然大幅度增加,， 隨之而來的是住院床位的供不應求，這些都對兒科臨床造成巨大的壓力,。因此,，兒科醫(yī)務工作者準確識別呼吸道病毒感染，制定恰當?shù)脑\治策略和應對措施,，避免抗生素的過度使用是個非常重要的臨床實際問題,。

1　兒科呼吸道病毒病原的診斷概況

2000年以前， 兒科最常見的,、 經(jīng)典的呼吸道病毒包括： 呼吸道合胞病毒,、 流感病毒（甲型和乙型）、 腺病毒,、 副流感病毒（1,、 2、 3型）,。之所以說是“最常見的”和“經(jīng)典的”,， 是因為這些呼吸道病毒發(fā)現(xiàn)于20世紀50年代以后， 與急性呼吸道感染的病原關系的確定經(jīng)歷了病毒分離、 血清學試驗（雙份血清）和流行病學研究,， 因此這些結(jié)果和結(jié)論翔實可靠、經(jīng)久不衰,。2000年以后,，隨著分子生物學技術的不斷創(chuàng)新、 推廣和應用,， 人偏肺病毒,、 鼻病毒和副流感病毒（4型）與兒科急性呼吸道感染的關系逐漸被大家所認識和重視。還有一些新發(fā)的病毒（如博卡病毒）,， 雖然病原學關系尚待確認,， 但是由于較高的檢出率， 也引起了大家的高度關注［1］ ,。

由于新的技術和方法不斷研發(fā)和推出,，現(xiàn)代的病毒感染的病原診斷可以根據(jù)各醫(yī)院的具體情況選擇不同的技術和方法，并且可以通過融會貫通,、聯(lián)合應用多種技術,，使得病毒病原的診斷更加切合患兒的實際（即不同的病程階段和病情嚴重程度）［1］?？捎玫募夹g包括病毒分離（僅限于常見呼吸道病毒,，仍為不容置疑的金標準）、用各種免疫學方法檢測病毒抗原（如直接或間接免疫熒光法,、酶聯(lián)免疫法,、免疫層析法等）和病毒核酸擴增法（檢測病毒的基因-DNA或者RNA）。這三種類型是在感染的相應部位檢測病毒,；還可以用檢測病毒特異性抗體的方法（血清學試驗）來做出病毒病原診斷,，要根據(jù)患兒的不同的病程階段來考慮選擇檢測不同的特異性抗體種類。具體的方法在這期《中國實用兒科雜志》有專門的文章介紹,，本文不贅述,。本文將結(jié)合文獻、國內(nèi)兒科臨床的具體情況和筆者所在實驗室的經(jīng)驗和體會,，就當前面對眾多的方法和技術,，兒科醫(yī)師和醫(yī)院的病毒病原檢測的相關部門如何選擇診斷技術作一個簡要論述，以供參考,。

1.1　病毒分離　盡管常見呼吸道病毒的分離是公認的,、無可置疑的病原診斷金標準，對于絕大部分的兒童醫(yī)院來說還是無法做到,，只有少部分兼做研究的醫(yī)院可做,。用病毒分離的方法，連續(xù)性地每年從患兒的臨床標本中分離到各種呼吸道病毒的流行毒株,，對于診斷病毒學的可持續(xù)發(fā)展是一項十分重要,、不可或缺的工作［2］,。

1.2　病毒抗原檢測　病毒抗原是指在病毒侵入呼吸道上皮細胞后活躍復制、增殖的過程中產(chǎn)生的病毒蛋白,，因為可以在感染過程中刺激肌體產(chǎn)生相應的抗體而稱為抗原,。病毒只有在侵入靶細胞并且活躍增殖的情況下才能引起呼吸道癥狀。因此在疾病的早期,，抗原檢測（不管采用何種方法）是對于病原確定以便正確診治的好策略,！其診斷價值不亞于傳統(tǒng)的病毒分離或快速病毒分離（shell vial），并且因為出結(jié)果快而使得其實用性優(yōu)于病毒分離［3］,。而諸多的抗原檢測方法中,，直接或間接免疫熒光法因為需要采集到患兒的呼吸道脫落上皮細胞（呼吸道病毒感染的靶細胞）作為檢測的標本，熒光標記的單克隆抗體與在細胞中病毒感染后增殖的特定部位［細胞核和（或）細胞漿］結(jié)合,，在熒光顯微鏡下可以直觀地看到特征性的定位熒光而判斷結(jié)果,，因此，有很強的特異性,。在發(fā)病的早期,，抗原檢測即可顯示熒光陽性［4］。該方法在采集到高質(zhì)量標本（含足夠量的呼吸道脫落上皮細胞）前提下,，敏感性和特異性可以與病毒分離相當,；另外，因操作時間相對較短（2～3 h）,，符合臨床上敏感,、特異和快速的要求［3］，因此,，在相當長的時期內(nèi)成為國內(nèi)外兒科的病毒診斷實驗室的首選方法,，并且在當前也不失為最好的方法之一，尤其對于住院患兒來說更是推薦選用,。目前有商品化的試劑盒,，可以用1份標本同時檢測7種常見的呼吸道病毒（如果加上偏肺病毒的單克隆抗體，可以檢測8種呼吸道病毒,，國外的試劑盒是這樣組合的）［5］,。 免疫層析法（如金標法等“紙條法”）因為出結(jié)果快、操作簡便（操作人員不需要特殊的技術專長）,，在臨床上也是十分受歡迎,，國外的專科醫(yī)師診所（成人及兒科）內(nèi)由醫(yī)師或護士直接操作,，國內(nèi)還是由臨床檢驗部門來做,。目前國內(nèi)外應用最多的“紙條法”是流感病毒（甲型/乙型），質(zhì)量好的試劑盒在敏感性和特異性上可與病毒分離相比［6］。國外兒科廣泛應用的免疫層析法還有呼吸道合胞病毒,、腺病毒［3］,，而國內(nèi)尚處于開始階段。相比免疫熒光法,，“紙條法”取1份標本只能做單一的病毒,，對標本的質(zhì)量（是否采集到足夠量的上皮細胞）也無法判斷，故對于普遍反映該方法的敏感性低的問題筆者在此難以評價,。

1.3　病毒核酸檢測　病毒核酸檢測是隨著20世紀80年代末聚合酶鏈反應（PCR）技術發(fā)明以來快速發(fā)展起來的。由于與抗原檢測相比,，核酸擴增技術的敏感性大大的增加了檢出率,，而且實時熒光PCR或RT-PCR又可以克服早期PCR技術的實驗室污染問題的瓶頸，使得核酸檢測在呼吸道病毒病原診斷中快速地得到推廣應用,。近年來,，多重PCR技術使得用同一管反應能夠同時檢測幾乎所有的呼吸道病毒，而且隨著反應時間的縮短,，儀器的日漸小型化,，在一些實驗室多重核酸檢測的技術逐步取代了抗原檢測，尤其是當一些新上市的試劑盒是以“癥狀為組合”為設計理念的（developed as syndromic panels）,，加上了如肺炎支原體,、肺炎衣原體等呼吸道病毒以外的常見病原，更加受到了臨床的青睞,。然而盡管有這些突出的優(yōu)點,，核酸檢測的短處也日益顯露出來。首先,，核酸擴增法檢測過于靈敏,，有極少量的病毒基因也能被檢測到，而且由于可檢測到病毒核酸的時間窗長,，陽性結(jié)果不能明確告訴醫(yī)師是本次感染的病毒病原,，還是以前（上次）感染遺留的病毒核酸，該病毒是否還有感染性（傳染性）［7］,。多重PCR還往往得到兩種以上病毒同時陽性的結(jié)果,，以至于很難判斷哪種病毒是本次臨床疾病的病原；這種情況在抗原檢測中就很少發(fā)生,，因為抗原檢測法得到的是病毒活躍增殖中產(chǎn)生的病毒蛋白,，而且在發(fā)病早期出現(xiàn)，陽性結(jié)果維持時間不長,，在急性呼吸道感染中,，陽性結(jié)果從臨床癥狀出現(xiàn)時起，一般維持7 d左右（最長不超過10 d）并呈逐漸減弱的趨勢。所以,，抗原檢測仍然有著其他方法所缺乏的優(yōu)勢［3］,，那就是與病毒活躍增殖的密切相關性所決定的對病原診斷的可靠性。

2    兒科呼吸道病毒病原的診斷所面臨的挑戰(zhàn)

盡管病毒病原診斷的技術日新月異,，也被越來越多的醫(yī)院臨床所接受應用,，呼吸道病毒病原的診斷仍然面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。

最突出的是理念的挑戰(zhàn),！有一種觀點非常具有代表性,，那就是由于大多數(shù)呼吸道病毒缺乏特異的治療藥物，臨床醫(yī)師會認為準確的病毒病原診斷的實際意義不大,，根據(jù)血常規(guī),、C反應蛋白等檢測結(jié)果判斷是病毒感染，對癥治療就是了,。這種想法阻礙了病毒病原的診斷,。實際上不同的病毒所引起的疾病預后是不一樣的，不同的呼吸道病毒可能引起相似的臨床表現(xiàn),，而有了準確的病原診斷,，一定會促進臨床的診斷和治療。例如,，在當前（2018—2019年流感季）流感流行中,，如果沒有流感病毒的病原診斷，不會使臨床醫(yī)師認識流感合并的腦病,，會把腦病當成一般的病毒性腦炎和腦膜炎,，而忽略流感本身。還有,，即使在流感高峰季節(jié),，流感樣病例中仍有相當一部分是由流感病毒以外的呼吸道病毒引起的，如果不做病原檢測而盲目使用抗流感藥物,，會使得耐藥毒株快速生成,。因此，臨床醫(yī)師對病原檢測必要性的認識是十分重要的,，臨床醫(yī)師的需求直接影響了一個醫(yī)院的病毒病原診斷的應用,、發(fā)展和進步。 

其次,，盡管目前市場上供應的診斷試劑很多,，而且還在不斷增加，可應用于臨床的（即有批準文號的）診斷試劑遠遠不能滿足需求,，而且良莠并存,，因此,，在應用于臨床前，應該認真地做好擬采用的試劑盒的質(zhì)控和評估,，最理想的是與公認的標準方法進行比較,，以保證檢測質(zhì)量的可靠性，這在發(fā)達國家的臨床檢驗科已經(jīng)是常規(guī)了,，在國內(nèi)可能大部分的兒科醫(yī)院都做不到,，所以會對檢測結(jié)果的可靠性大打折扣。此外,，在應用了某一種診斷方法和試劑一段時間后,，應該及時總結(jié)和回顧所用試劑的敏感性、特異性和可靠性,，加強同臨床醫(yī)師的溝通,，以不斷改進。

最后,，也是不能忽視的最重要的一點，采集到合格的標本是取得可信結(jié)果的第一步,，也是基本保證,！臨床上要對采集標本的人員（住院醫(yī)師或護士）進行培訓，而檢驗人員應該對送來的標本進行初步評估,，看是否真正采集到了符合要求的標本,。因為只有病毒在細胞內(nèi)快速增殖才能引起相應的疾病，檢測到的結(jié)果才是真正可信的結(jié)果,。對于不合格的標本,，不能簡單地打上“陰性”了事，而要注明標本“不合格”,，以便于臨床醫(yī)師對結(jié)果做出客觀的判斷,。

3    結(jié)語與展望

盡管與發(fā)達國家相比，我們的呼吸道病毒病原診斷的廣度和深度都存在著很大的差距,，但是我們的進步已經(jīng)在路上,。《中國實用兒科雜志》作為在我國兒科同行中頗具影響力的學術期刊,，本期重點選題的設計和實施就是有力的說明,！相信隨著病毒病原診斷技術的不斷進步發(fā)展和普及應用，兒科同道們對病毒性呼吸道感染的認識和診治水平會得到長足的進步,，這是一項使醫(yī)患雙方都能獲益的舉措,。

參考文獻 (略)

（2019-01-20收稿）