今天，我將為大家解讀一篇3.96分的SCI,，借此來學(xué)習(xí)GEO數(shù)據(jù)庫甲基化芯片發(fā)SCI的套路,，文章的題目是：Aberrantly  methylated-diferentially expressed genes and  pathways in colorectal cancer。

首先簡單介紹一下,，GEO數(shù)據(jù)庫(GENE EXPRESSION OMNIBUS)是NCBI旗下主打基因表達(dá)芯片的數(shù)據(jù)庫,，它的網(wǎng)址是http://www.ncbi.nlm./geo，或者直接通過PUBMED的菜單欄進(jìn)入,。

小碩在此申明,，GEO數(shù)據(jù)庫的芯片數(shù)據(jù)是不花錢的！而且數(shù)據(jù)海量,，更新較快,！小伙伴們迫不及待了吧,Let′s go!

全文思路明確,，從GEO數(shù)據(jù)庫中下載4張芯片,，其中2張基因表達(dá)芯片(GSE68468, GSE44076)和2張甲基化的芯片(GSE29490, GSE17648)，是不是感覺芯片在手,，天下我有,？

接著利用GEO2R工具找出甲基化的差異基因(methylated-DEGs),，DAVID網(wǎng)站做功能和富集分析，STRING網(wǎng)站做蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI),，利用Cytoscape軟件的MCODEapp構(gòu)建PPI聚類功能模塊,。

最終，找出了異常甲基化的差異表達(dá)基因和通路,，這些Hub基因可能作為異常甲基化的生物標(biāo)志物,，以此服務(wù)于結(jié)腸癌的精準(zhǔn)治療。

“Totally 186 CRC and 55normal mucosa specimens were enrolled in GSE68468 (platform: GPL96 AfymetrixHuman Genome U133A Array) while 98 CRC and 50 normal mucosa specimens wereenrolled in GSE44076 (platform: GPL13667 Afym[1]etrix Human Genome U219 Array).”這句來源于原文中,，咋一看，不了解GEO的小伙伴可能有點(diǎn)懵,，一會(huì)GSE,一會(huì)GPL?請看下面表格內(nèi)容,。

總結(jié)一下，GEO數(shù)據(jù)庫的表達(dá)譜信息主要儲(chǔ)存在DataSets和Profiles中,，而數(shù)據(jù)下載說到底就是要得到表達(dá)矩陣,，即“基因在行，樣本在列”的矩陣,。

在下圖的GEO DataSets輸入研究的癌癥,，然后就可以選擇自己需要的芯片，里面關(guān)于芯片的信息非常詳細(xì),，下載原始文件,，整理后即可得到需要的表達(dá)矩陣。哈哈,，還是挺容易實(shí)現(xiàn)的,。

利用GEO數(shù)據(jù)庫自帶的GEO2R工具將樣本分為正常組和病例組,，設(shè)定cut-off值(P < 0.05and |t| > 2),尋找出差異表達(dá)基因(DEGs)和差異甲基化基因(DMGs),。

再利用EXCEL中的MATCH函數(shù)進(jìn)行匹配，去除重疊的基因,，同時(shí)獲得甲基化芯片和表達(dá)譜芯片的交集,，最終得到低甲基化-高表達(dá)基因411個(gè)，高甲基化-低表達(dá)基因239個(gè),，利用R軟件代碼實(shí)現(xiàn)韋恩圖制作,，文中的韋恩圖確實(shí)不錯(cuò)哈。

選取典型的芯片的TOP100基因(包括50高表達(dá)和50低表達(dá)基因)做差異基因的熱圖,，可通過R代碼實(shí)現(xiàn)熱圖的制作,。微信公眾號回復(fù)“熱圖”，可獲得R軟件熱圖制作代碼,。

DAVID網(wǎng)站(網(wǎng)址https://david./)實(shí)現(xiàn)GO功能富集分析,，這個(gè)還是比較簡單的，直接上圖了,。分別從生物學(xué)過程(BP),，細(xì)胞組成(CC)，分子功能(MF)對低甲基化-高表達(dá)基因,、高甲基化-低表達(dá)基因功能注釋,，選取排名前5的富集分析制成下表。

同樣,，利用DAVID網(wǎng)站進(jìn)行KEGG通路分析，分別預(yù)測了低甲基化-高表達(dá)基因,、高甲基化-低表達(dá)基因富集的通路,。

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)通過STRING網(wǎng)站來制作(網(wǎng)址https:///),，PPI聚類功能模塊則用Cytoscape軟件的MCODEapp制作。其中PPI網(wǎng)絡(luò)圖,，以Interactionscore＞0.4作為cut-off值,；利用Cytoscape軟件，篩選出MCODE評分＞3,、節(jié)點(diǎn)數(shù)＞4的PPI網(wǎng)絡(luò)中的模塊制作聚類模塊分析圖,。篩選出節(jié)點(diǎn)degree大于10的即為Hub基因。

最終分別篩選出低甲基化-高表達(dá)基因排名前五的Hub基因：CAD,CCND1, ATM, RB1 and MET,；高甲基化-低表達(dá)基因排名前五的Hub基因：EGFR,ACTA1, SST, ESR1 and DNM2,。

分別將低甲基化-高表達(dá)的Hub基因和高甲基化-低表達(dá)的Hub基因在TCGA中觀察Hub基因的甲基化狀態(tài)和表達(dá)差異,，最終結(jié)果如下表，大部分Hub基因在TCGA中和GEO數(shù)據(jù)庫中的甲基化狀態(tài)和表達(dá)差異是一致的,，這對作者的GEO數(shù)據(jù)庫分析加強(qiáng)了說服力,。

綜上，可以看出本文甲基化數(shù)據(jù)挖掘步驟：

(1)GEO芯片下載和預(yù)處理：GEO數(shù)據(jù)庫直接下載原始數(shù)據(jù),；R軟件的GEOquery包(上bioconductor官網(wǎng)搜索),。預(yù)處理一般就是將原始文件整理成我們需要的表達(dá)矩陣。

(2)差異基因和甲基化基因的篩選：本文采用的是GEO在線工具GEO2R分組后設(shè)定cut-off值P < 0.05and |t| > 2,，分別可以篩選出高,、低表達(dá)基因，高,、低甲基化基因,，利用EXCEL中的MATCH函數(shù)去除重疊的基因,，同時(shí)對低甲基化高表達(dá)的基因求交集，對高甲基化低表達(dá)基因求交集,。制作韋恩圖,，選取典型芯片做熱圖。當(dāng)然,，這一步也可以用R軟件跑,，最終結(jié)果是一致的。

(3)GO和KEGG分析：DAVID網(wǎng)站直接實(shí)現(xiàn),。

(4)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,、模塊分析和Hub基因選擇：STRING網(wǎng)站做蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，利用Cytoscape軟件的MCOD app構(gòu)建PPI聚類功能模塊,。通過cut-off值設(shè)定,，節(jié)點(diǎn)degree大于10的即為Hub基因。

(5)TCGA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證：利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析Hub基因的甲基化狀態(tài)和表達(dá)差異,，看是否與GEO數(shù)據(jù)庫一致,，以增強(qiáng)說服力。

做到這里,，已經(jīng)3.96分了,，小碩設(shè)想，如果繼續(xù)把Hub基因進(jìn)行共表達(dá)或預(yù)后分析,，是不是影響因子又得上漲呢,！當(dāng)然，前面這些步驟都不用花經(jīng)費(fèi),！假如你的老板經(jīng)費(fèi)充足,，繼續(xù)來個(gè)小樣本的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證吧，估計(jì)小伙伴們手已癢癢,，趕緊準(zhǔn)備發(fā)文吧,！我們明天將手把手教你R語言實(shí)操分析GEO數(shù)據(jù)庫甲基化芯片。

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