純種發(fā)酵和混菌發(fā)酵對野木瓜果酒品質(zhì)的影響

劉小雨,，李科,，張惟廣*

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶,，400715)

摘 要 為探討純種與混菌發(fā)酵對野木瓜果酒品質(zhì)的影響,，對季也蒙畢赤酵母、異常漢遜酵母,、克斯魯假絲酵母,、安琪SY釀酒酵母、安琪RW釀酒酵母,、安琪B2818釀酒酵母進(jìn)行純種發(fā)酵,，對季也蒙畢赤酵母和安琪SY釀酒酵母、異常漢遜酵母和安琪SY釀酒酵母,、克斯魯假絲酵母和安琪SY釀酒酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵,，然后測定各組果酒的基本理化指標(biāo)、香氣,，并進(jìn)行感官評價,。結(jié)果顯示：釀酒酵母純種發(fā)酵果酒的殘?zhí)恰⑦€原糖、總酸,、揮發(fā)酸比混菌發(fā)酵果酒低,，但酒精度較高；在9種果酒中共檢出79種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),，其中醇類,、酯類物質(zhì)的含量比較多，酯類物質(zhì)含量最多,。醛酮類物質(zhì)含量僅次于醇類及酯類,，而酸類、芳香族類,、萜類及烷烴類組分的含量較少,，對香氣形成有益的物質(zhì)在非釀酒酵母純種發(fā)酵果酒中檢出較多；在感官層面,，非釀酒酵母純種發(fā)酵果酒評分高于混菌發(fā)酵,，混菌發(fā)酵高于釀酒酵母純種發(fā)酵，其中季也蒙畢赤酵母純種發(fā)酵果酒感官評分最高,。因此,，選擇季也蒙畢赤酵母純種發(fā)酵野木瓜果酒最為合適。

關(guān)鍵詞 純種發(fā)酵,；混菌發(fā)酵,；野木瓜果酒；品質(zhì)

野木瓜別稱皺皮木瓜,，屬薔薇科灌木叢植物,，享有“百益之果”的美稱[1]。野木瓜營養(yǎng)豐富,，富含蛋白質(zhì),、維生素、有機(jī)酸以及酶等,，其中有機(jī)酸包括檸檬酸、齊墩果酸等,，酶包括過氧化氫酶和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等[2],。齊墩果酸作為治療肝病的輔助藥，在野木瓜中檢出含量平均為0.105 5%[3],。SOD能清除自由基,，延緩衰老，其在新鮮野木瓜中檢出含量平均為3 227 U/g,，為所有水果之最[4],。野木瓜果酒是以新鮮野木瓜為原料，人工添加釀酒酵母，輔助現(xiàn)代食品加工工藝釀制而成,，其色澤明亮,、酸甜適口、香氣醇厚,，且保留了野木瓜的營養(yǎng)成分,。

目前，釀造野木瓜果酒大多是用活性干酵母純種發(fā)酵,，其產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定安全,，但香氣淡薄。近年來非釀酒酵母的增香作用引起研究者廣泛關(guān)注,，其在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生大量對果酒風(fēng)味有積極影響的甘油,、酯類代謝產(chǎn)物[5]，如VIANA等[6]人從38種非釀酒酵母包括假絲酵母,、孢漢生酵母等中選取產(chǎn)酯能力強(qiáng)的酵母與釀酒酵母混菌發(fā)酵,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H. osmophila 1471能夠消耗90%的初始糖，且產(chǎn)生較多對果酒風(fēng)味有積極作用的物質(zhì)如乙酸,、中鏈脂肪酸及乙酸乙酯等,。

因此本實驗將對季也蒙畢赤酵母、異常漢遜酵母,、克斯魯假絲酵母,、安琪SY釀酒酵母、安琪RW釀酒酵母,、安琪B2818釀酒酵母進(jìn)行純種發(fā)酵,，并選擇安琪SY釀酒酵母(釀酒酵母中安琪RW釀酒酵母生長速率慢于另外2種釀酒酵母，安琪B2818釀酒酵母絮凝性過強(qiáng),，這會導(dǎo)致發(fā)酵緩慢或中止,，且安琪SY釀酒酵母發(fā)酵野木瓜果酒技術(shù)相對成熟。因此,，選擇安琪SY釀酒酵母與3株非釀酒酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵,。)與3株非釀酒酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵(非釀酒酵母對香氣影響大于釀酒酵母，故需對3株非釀酒酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵研究),，通過比較混菌發(fā)酵果酒與純種發(fā)酵果酒的基本理化指標(biāo),、香氣成分、感官評分,，以此確定發(fā)酵野木瓜果酒的最適菌種,。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野木瓜：10月份采收于重慶市綦江區(qū)

安琪SY釀酒酵母、安琪RW釀酒酵母,、安琪B2818釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司,；季也蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii SICC 2。438)、異常漢遜酵母(Hansenula anomala SICC 2.96) ,、克魯斯假絲酵母(Candida krusei SICC 2.547)：四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院,；KHCO3、K2S2O5,、NaCl： 分析純,，成都科龍化工試劑廠；正構(gòu)烷烴混合標(biāo)品(C3～C9,、C10～C25)：色譜純,，百靈威科技有限公司；2-辛醇：色譜純,，sigma公司,；無水乙醇：色譜純，成都科龍化工試劑廠,。

1.2 儀器與設(shè)備

LHS-50SC恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海齊欣科學(xué)儀器有限公司,；ZWY-2102C恒溫?fù)u床,上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-30KBS滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠,；SW-OJ-1FD潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司,；LG10-2.4A離心機(jī),北京醫(yī)用離心機(jī)廠；UV1000紫外可見分光光度計,上海天美科學(xué)儀器有限公司,；XH-C漩渦混合器,金壇市白塔新寶儀器廠,；BX43顯微鏡,日本OLYMPUS公司；QP2010氣質(zhì)聯(lián)用儀,日本島津公司,；手動進(jìn)樣器,、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭,美國supelco公司。

1.3 試驗方法

野木瓜果酒純種與混菌發(fā)酵試驗情況見表1,。

表1 野木瓜果酒發(fā)酵試驗組
Table 1 The experimental groups of Stauntonia chinensis
wine

1.3.1 野木瓜果酒的純種發(fā)酵

將野木瓜加水打漿制成野木瓜汁,，添加適量的果膠酶，再加入一定量的K2S2O5,。同時添加蔗糖,、KHCO3調(diào)整成分(糖、酸),，準(zhǔn)備接種發(fā)酵,。6株酵母先接種至豆芽汁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h后,，再接種至發(fā)酵醪液中，接種量107 CFU/mL,，發(fā)酵溫度為22 ℃,。當(dāng)外觀糖度不變時，即發(fā)酵結(jié)束。分離酵母,，密封陰涼處貯藏酒液,。

1.3.2 野木瓜果酒的混菌發(fā)酵

混菌方式為先分別接種3株非釀酒酵母裝至有上述野木瓜汁的發(fā)酵瓶中，再接種安琪SY釀酒酵母,，發(fā)酵溫度為22 ℃,。當(dāng)外觀糖度不變時，即發(fā)酵結(jié)束,，然后分離酵母,，密封陰涼處貯藏酒液。

1.3.3 野木瓜果酒純種與混菌發(fā)酵理化指標(biāo)的測定

外觀糖用手持式糖度計測定,；pH用酸度計直接測定,；還原糖用DNS法測定[7]；酒精度,、干浸出物,、總酸、揮發(fā)酸,、游離SO2,、總SO2含量的測定按照GB/T 15038—2006測定。

1.3.4 野木瓜果酒純種與混菌發(fā)酵香氣物質(zhì)的測定

1.3.4.1 頂空固相微萃取法

分別取8 mL野木瓜酒液和2 g NaCl加入到20 mL萃取瓶中,。同時用聚四氟乙烯隔墊將其進(jìn)行密封,，于45 ℃下水浴攪拌平衡15 min，待平衡后插入已經(jīng)活化充分的萃取頭,，頂空萃取吸附40 min,，萃取完成后再插入到氣相色譜儀的進(jìn)樣口解析5 min。

1.3.4.2 氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)分析條件

GC條件：DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),；載氣為氦氣,，流速1 mL/min，壓力47.7 kPa,；分流比為5∶1,；進(jìn)樣口溫度為230 ℃；升溫程序為35 ℃并保持4 min,，以5 ℃/min的升溫速度從35 ℃升至55 ℃,，保持2 min，再以8 ℃/min的升溫速度升至120 ℃,，最后以10 ℃/min的升溫速度升至230 ℃,，保持4 min。

MS條件：電離方式為EI,；電子能量70 eV,；離子源溫度230 ℃,；采集模式：全掃描(Scan)；四級桿溫度150 ℃,；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～450,。參照李記濤[8]方法修改。

1.3.4.3 香氣成分定性與定量

由GC-MS分析所得的質(zhì)譜圖經(jīng)計算機(jī)自帶的NIST 08譜庫檢索,，并結(jié)合保留指數(shù)(retention index, RI)進(jìn)行定性,。RI的測定：將正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品C3～C9、C10～C25溶于甲醇,，配制到適宜濃度,，然后進(jìn)樣，得到標(biāo)準(zhǔn)譜圖,。取其保留時間,，按照程序升溫計算公式計算保留指數(shù)，并與譜庫自帶物質(zhì)保留指數(shù)進(jìn)行對照,。

RI=100n+100(tx-tn)/(tn+1-tn)

(1)

式中：tx,、tn和tn+1分別為被分析組分、碳原子數(shù)處于n和n+1的正構(gòu)烷烴(tn<tx<tn+1)的流出峰保留時間[9],。

半定量法確定各香氣成分在野木瓜果酒中的含量,，具體操作方式：取20 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液置于8 mL酒液中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在混合體系中的濃度為1 225.4 μg/L,，以峰面積歸一化法,，按照下列公式計算各香氣物質(zhì)含量：

香氣物質(zhì)含量

校正因子f計為1。樣品重復(fù)3次,，計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差,。

1.3.5 果酒香氣感官品評

選10名經(jīng)驗豐富的食品學(xué)院品酒人員，對不同組野木瓜果酒的香氣進(jìn)行評分,，總分5分,。果香很濃郁，評分4～5分,；果香較濃郁,，評分3～4分；有果香,，評分2～3分,；果香不明顯，評分小于2分[10],。并用SPSS Statistics 19.0軟件對感官評分進(jìn)行差異性顯著分析,。

2 結(jié)果與分析

2.1 野木瓜果酒純種與混菌發(fā)酵理化指標(biāo)分析

純種發(fā)酵與混菌發(fā)酵野木瓜果酒的基本理化指標(biāo)如表2。由表2可知,，外觀糖和還原糖呈現(xiàn)相似特征,，非釀酒酵母純種發(fā)酵外觀糖度和還原糖度較高,，混菌發(fā)酵次之，釀酒酵母純種發(fā)酵外觀糖度和還原糖度最低,。整體來說，酵母利用糖基質(zhì)還不夠徹底,，殘余糖度較高,，適用于釀制半干型果酒。

釀酒酵母產(chǎn)酒精能力更強(qiáng),，尤其安琪SY酵母和安琪RW酵母更是達(dá)到13.30,、13.10%VOL，在p<0.05水平上,，與非釀酒酵母產(chǎn)酒精能力有顯著性差異,。混合酵母發(fā)酵酒精度均達(dá)到12.00%VOL以上,，滿足果酒發(fā)酵酒精度要求,。

干浸出物反映果酒在一定條件下的非揮發(fā)性物質(zhì)的總和，包括游離酸,、單寧,、色素、果膠,、低糖等,，是評價果酒質(zhì)量的一項指標(biāo)。非釀酒酵母純種發(fā)酵時干浸出物含量均較高,，與其他組有顯著性差異(p<0.05),。

非釀酒酵母產(chǎn)總酸整體比釀酒酵母和混菌發(fā)酵低，混菌發(fā)酵又比釀酒酵母純種發(fā)酵產(chǎn)酸低,，說明非釀酒酵母具備一定的降酸能力,，這與CABRANES[11]實驗結(jié)果一致。野木瓜果酒整體酸度偏高,，利用非釀酒酵母進(jìn)行生物降酸是一個值得探討的課題,。揮發(fā)酸被認(rèn)為果酒異味物質(zhì)[12]，而季也蒙畢赤酵母和異常漢遜酵母發(fā)酵果酒產(chǎn)生的揮發(fā)酸最少,。發(fā)酵完成的野木瓜果酒中游離SO2含量在36.48～54.40 mg/L之間,，總SO2含量在73.17～92.16 mg/L。由于采用碘量法測定SO2,，可能存在虛高情況[13],。

表2 酵母發(fā)酵野木瓜果酒理化指標(biāo)
Table 2 Physiochemical indexes of Stauntonia chinensis wine by different yeasts

注：采用Duncan’s multiple range test方法分析，同列不同字母表示在p<0.05的水平上差異顯著,；表中序號同表1,。

2.2 野木瓜果酒純種與混菌發(fā)酵的香氣物質(zhì)比較分析

野木瓜果酒純種與混菌發(fā)酵揮發(fā)性風(fēng)味成分定性定量結(jié)果如表3,。結(jié)果表明，9種野木瓜果酒共鑒定出79種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),，包括5種醇類,、33種酯類、2種酸類,、17種醛酮類,、8種萜類、11種芳香族類和3種烷烴類,。

表3 酵母發(fā)酵野木瓜果酒香氣物質(zhì)
Table 3 Aroma components of Stauntonia chinensis wine by different yeasts fermentation

續(xù)表3

續(xù)表3

注：表中數(shù)據(jù)單位為μg/L,；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0～20%；ND表示未檢出,；表中序號同表1,。

2.2.1 醇類組分的比較分析

醇類物質(zhì)檢出為2～4個，但其含量卻較高,，達(dá)到4 804.73 ～ 11 764.23 μg/L,，其中第2組果酒產(chǎn)醇類物質(zhì)最多，第7組產(chǎn)醇類物質(zhì)最少,，此類物質(zhì)為果酒香氣的重要組成部分,。醇類物質(zhì)含量主要有異戊醇和苯乙醇，前者在9組果酒中檢出含量在1 656.06～8 117.30 μg/L之間,，后者檢出含量在1 343.23～3 539.61 μg/L之間,。可以發(fā)現(xiàn),，異戊醇和苯乙醇在混菌發(fā)酵果酒和釀酒酵母純種發(fā)酵果酒中明顯比非釀酒酵母純種發(fā)酵果酒中的含量要低,，且苯乙醇具有玫瑰香氣，對果酒整體香氣的形成有益[14-15],。由此說明,，在醇類物質(zhì)層面，非釀酒酵母純種發(fā)酵對果酒香氣提升有貢獻(xiàn),。

2.2.2 酯類組分的比較分析

不同組果酒酯類物質(zhì)檢出為15～24個,，含量為6 379.31～23 016.30 μg/L。各組野木瓜果酒的酯類物質(zhì)總含量排序為1>2>8>9>7>4>5>6>3,，總體而言,，非釀酒純種發(fā)酵產(chǎn)酯能力最強(qiáng)，其次為非釀酒酵母與安琪SY釀酒酵母混菌發(fā)酵,，釀酒酵母純種發(fā)酵產(chǎn)酯能力最弱,，該結(jié)論與文獻(xiàn)[16-18]類似。另外,，第3組酵母為克魯斯假絲酵母,，屬非釀酒酵母,，其產(chǎn)酯較少，這可能與其不善于利用野木瓜基質(zhì)或基因表型有關(guān),。在這9種果酒中癸酸乙酯,、辛酸乙酯、己酸乙酯,、月桂酸乙酯,、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯,、苯甲酸乙酯、反式-4-癸烯酸乙酯,、棕櫚酸乙酯等含量均較高,，其是構(gòu)成酯類化合物的主體部分。另外,，酯類化合物單體具有一定的果香味,，雖然在果酒中的閾值較低，但對果酒整體香氣貢獻(xiàn)顯著,。因此,，在酯類物質(zhì)層面，選擇季也蒙畢赤酵母發(fā)酵野木瓜果酒對香氣的形成最為有益,。

2.2.3 酸類組分的比較分析

酸類物質(zhì)檢出較少,，主要為辛酸和癸酸，含量在56.16～442.28 μg/L,，這低于其在果酒中的閾值水平[19],，對果酒整體香氣貢獻(xiàn)不顯著。但該類物質(zhì)也是果酒中的重要呈味物質(zhì)[20],。

2.2.4 醛酮類組分的比較分析

醛酮類物質(zhì)其檢出種類為4～8個,，含量在1 617.70～6 574.75 μg/L之間，僅次于醇類,、酯類物質(zhì),。醛酮類物質(zhì)中的壬醛有青草香，苯甲醛具有杏仁香及堅果香,，雖然在果酒中的含量較少,，但對果酒的整體香氣也是有一定的影響[21-24]。由表3可知,，第8,、9組產(chǎn)醛酮類物質(zhì)最多，第6組產(chǎn)醛酮類物質(zhì)最少,。

2.2.5 萜類,、芳香族類,、烷烴類組分的比較分析

萜類物質(zhì)主要來源于原料本身，其在果酒中檢出較少,，為117.83～ 807.83 μg/L,，對果酒整體香氣貢獻(xiàn)較小。芳香族類化合物檢出4～7種,，含量為232.10～2 926.89 μg/L,，其中第2組和第8組產(chǎn)芳香族化合物最高。烷烴類化合物檢出1～2種,，含量為24.47～114.89 μg/L,。

2.3 野木瓜果酒香氣感官品評

9組果酒感官品評評分結(jié)果如表4。釀酒酵母,、非釀酒酵母純種發(fā)酵和混菌發(fā)酵釀制的果酒感官評分之間彼此有顯著性差異(p<0.05),。另外，克魯斯假絲酵母發(fā)酵果酒感官評分不及另外2種非釀酒酵母,，其混菌發(fā)酵果酒也是如此,。9組果酒按感官評分由高到低依次為季也蒙畢赤酵母、異常漢遜酵母,、異常漢遜酵母混合安琪SY釀酒酵母,、季也蒙畢赤酵母混合安琪SY釀酒酵母、克魯斯假絲酵母混合安琪SY釀酒酵母,、克魯斯假絲酵母,、安琪SY釀酒酵母、安琪RW釀酒酵母,、安琪B2818釀酒酵母,。整體而言，非釀酒酵母純種發(fā)酵果酒評分高于混菌發(fā)酵,，混菌發(fā)酵高于釀酒酵母純種發(fā)酵,。

表4 野木瓜果酒果香感官品評得分
Table 4 Sensory scores of aroma of the Stauntonia
chinensis wine

注：采用Duncan’s multiple range test方法分析，同列不同字母表示在p<0.05的水平上差異顯著,。

3 討論與結(jié)論

比較9種野木瓜果酒理化指標(biāo),，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母產(chǎn)酒精度最高、殘?zhí)亲钌?，與非釀酒酵母在p<0.05水平上有顯著性差異,，混菌發(fā)酵酒精度也能達(dá)到12.00%VOL以上，滿足果酒生產(chǎn)要求,。非釀酒酵母,、釀酒酵母純種發(fā)酵與混菌發(fā)酵干浸出物含量顯著差異(p<0.05)。季也蒙畢赤酵母和異常漢遜酵母發(fā)酵野木瓜果酒酸度和揮發(fā)酸均有一定程度地降低，說明其具備降酸能力,。

對野木瓜果酒純種與混菌發(fā)酵的香氣物質(zhì)進(jìn)行分析鑒定,，共檢出79種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括5種醇類,、33種酯類,、2種酸類、17種醛酮類,、8種萜類,、11種芳香族類和3種烷烴類。其中酯類物質(zhì)含量最多,，醛酮類物質(zhì)含量僅次于醇類及酯類,，而酸類、芳香族類,、萜類及烷烴類組分則含量較少,。醇類物質(zhì)、酯類物質(zhì)是野木瓜果酒最主要的香氣成分,。在醇類物質(zhì)層面，苯乙醇具有玫瑰香氣,，對于果酒整體香氣形成有益,，在9種果酒中，季也蒙畢赤酵母和異常漢遜酵母純種發(fā)酵果酒的苯乙醇含量較高,。在酯類物質(zhì)層面,，酯類物質(zhì)是構(gòu)成果酒香氣的重要成分，季也蒙畢赤酵母純種發(fā)酵野木瓜果酒中酯類物質(zhì)含量最多,。從對野木瓜香氣感官評定結(jié)果分析可知,，非釀酒酵母純種發(fā)酵果酒評分高于混菌發(fā)酵，混菌發(fā)酵高于釀酒酵母純種發(fā)酵,，其中季也蒙畢赤酵母純種發(fā)酵果酒感官評分最高,。因此，從果酒的基本理化指標(biāo),、香氣成分和感官評分綜合效果來看,，選擇季也蒙畢赤酵母純種發(fā)酵野木瓜果酒最為合適。