過去的四五年時間里，在癌癥治療領(lǐng)域里有一種新藥異軍突起,，它就是PD-1（程序性細(xì)胞死亡蛋白1）抑制劑,。在上市的短短三年間，已被美國FDA批準(zhǔn)用于包括惡性黑色素瘤,、非小細(xì)胞肺癌,、霍奇金淋巴瘤等近十種腫瘤的治療。而2018年6月15日,，CFDA正式批準(zhǔn)了國內(nèi)首個免疫療法藥物PD-1抑制劑（Opdivo）的上市,。PD-1抑制劑的上市及其對多種腫瘤較好的治療效果給無數(shù)癌癥患者帶來了新希望。正常情形下免疫系統(tǒng)會對聚集在淋巴結(jié)或脾臟的外來抗原產(chǎn)生反應(yīng),，促進具有抗原特異性的T細(xì)胞增殖,。而PD-1與程序性細(xì)胞死亡受體-配體1（PD-L1）結(jié)合，可以傳導(dǎo)抑制性的信號,，降低T細(xì)胞的增殖,。腫瘤細(xì)胞逃避T細(xì)胞摧毀的一種途徑是通過在表面產(chǎn)生PD-L1，T細(xì)胞表面的PD-1識別PD-L1后,，可以傳導(dǎo)抑制性信號,，T細(xì)胞就不能發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和向腫瘤細(xì)胞發(fā)出攻擊信號,。PD-1是通過解除腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的免疫療法，其作用機制是針對PD-1或PD-L1設(shè)計特定的抗體,，阻止PD-1和PD-L1的識別過程,，部分恢復(fù)T細(xì)胞功能，從而使T細(xì)胞可以殺死腫瘤細(xì)胞（圖1）,。

免疫細(xì)胞功能受共抑制和共刺激受體的調(diào)節(jié),。前兩代癌癥免疫治療藥物主要由阻斷免疫檢查點的拮抗劑抗體組成，例如PD1和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞蛋白4（CTLA4）,。展望未來,，用激動劑抗體靶向共刺激受體也有很大的希望，并且越來越多的藥物正在經(jīng)歷各個發(fā)展階段,。近期GSK公司腫瘤治療領(lǐng)域的研發(fā)人員在Nature Review Drug Discovery發(fā)表了綜述文章¹,，討論了免疫激動劑抗體設(shè)計和開發(fā)中的關(guān)鍵考慮因素和潛在缺陷，它們與拮抗劑抗體的區(qū)別特征以及在癌癥治療中的應(yīng)用前景,。例如,，在T細(xì)胞受體（TCR）激活后誘導(dǎo)共刺激受體的時間和持續(xù)時間以及細(xì)胞上共抑制受體表達的背景可能決定共刺激受體激活是否產(chǎn)生功能響應(yīng)。

圖1：PD1/PDL1抑制劑作用示意圖

目前研究中的免疫激動劑抗體靶點主要屬于B7-CD28家族和腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族（TNFRSF或TNFR）,。B7家族成員是重要的共刺激分子,，屬于免疫球蛋白家族，且由結(jié)構(gòu)相關(guān)的細(xì)胞表面蛋白配體組成,。B7可以與淋巴細(xì)胞上的受體CD28（Cluster of Differentiation 28）結(jié)合,，并通過共刺激和共抑制信號調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。B7-CD28家族的兩種主要共抑制受體,，CTLA4和PD1,，是第一批成功的癌癥免疫治療藥物的靶點，多種藥物已被批準(zhǔn)上市或處在臨床開發(fā)的后期階段,。CD28是共刺激受體,，是TCR激活后T細(xì)胞信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)。在與配體B7-1（CD80）和B7-2（CD86）結(jié)合后,，CD28激活并驅(qū)動T細(xì)胞功能,、增殖和存活的下游信號。誘導(dǎo)型T細(xì)胞共刺激分子（ICOS）是另一種共刺激受體,，對于響應(yīng)ICOS配體（ICOSLG）的活化和記憶T細(xì)胞的功能與存活非常重要,。早期開發(fā)的CD28激動劑會產(chǎn)生嚴(yán)重的臨床毒性作用，然而該領(lǐng)域在過去十年里取得了重大進展,。因此,，CD28和ICOS都是開發(fā)用于治療癌癥的治療性激動劑的靶點（表1）。 

表1：臨床開發(fā)中的共刺激激動劑抗體

TNFRSF是一個功能多樣的大型受體家族,，其相關(guān)結(jié)構(gòu)能介導(dǎo)一系列免疫和非免疫細(xì)胞功能,。在已知屬于該家族的29種受體中,，6種受體主要是作為免疫共刺激因子起作用（表1），分別是CD40,、OX40,、4-1BB（CD137）、CD27,、GITR（糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNFR相關(guān)蛋白）和CD30,。其他家庭成員，如DR3（死亡受體3）,、TNFR1、TNFR2,、LTβR（淋巴毒素β受體）和HVEM（皰疹病毒進入介質(zhì)）也具有免疫共刺激作用的潛力,；然而，尚不完全清楚這種共刺激作用的機制,，因為它可能因其他功能活動而復(fù)雜化,，例如在DR3和TNFR1的情況下通過細(xì)胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，或者在HVEM,、TNFR2和LTβR情況下與其他TNF配體和受體產(chǎn)生交叉反應(yīng)²,。CD40等6種共刺激受體可以在許多類型的免疫細(xì)胞中表達，包括T細(xì)胞,、B細(xì)胞,、自然殺傷（NK）細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞（APC），并且可以驅(qū)動免疫細(xì)胞的功能,、增殖和生存,。死亡受體是TNFRSF中的另一個亞類，在某些情況下它也可以介導(dǎo)免疫活性,。然而它們的主要功能是通過細(xì)胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域激活細(xì)胞死亡,，因而研究人員的綜述中并沒有囊括靶向死亡受體的激動劑抗體。

在這篇綜述中研究人員不僅討論了靶向癌癥中免疫共刺激受體的激動劑抗體,，也將激動劑抗體與拮抗劑抗體區(qū)分開來,，突出了激動劑抗體藥物相關(guān)的治療前景和發(fā)展挑戰(zhàn)，而且總結(jié)了目前正在開發(fā)用于癌癥治療藥物的臨床背景和組合方法,。

激動劑抗體的期望特征是具有以模擬天然配體活性的方式結(jié)合和激活靶受體的能力,。抗體是否可以作為激動劑受許多因素的影響,，包括結(jié)合表位,、親和力、效價,、受體占據(jù)程度和抗體可結(jié)晶片段（Fc）結(jié)構(gòu)域與Fcγ受體（FcγR）的相互作用等,。設(shè)計的拮抗劑一般是具有最高親和力的抗體并且能夠與配體競爭性地結(jié)合受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,，而對于激動劑設(shè)計則沒有硬性規(guī)則。詳細(xì)了解天然配體-受體復(fù)合物的結(jié)合特性可以幫助我們設(shè)計針對特定受體的最佳激動劑抗體,。受體的結(jié)構(gòu),、配體結(jié)合機制和信號傳導(dǎo)機制在受體家族中通常傾向于保守，但是在不同家族之間是非常獨特的,。因此,，我們應(yīng)該獨立考慮兩種主要類別的癌癥免疫激動劑（B7-CD28和TNFR）的共刺激受體結(jié)合和激活的機制。

圖2：抗體結(jié)構(gòu)示意圖

B7家族配體（特別是B7-1和ICOSLG）在細(xì)胞表面形成同源二聚體的傾向有利于單個配體二聚體與免疫突觸的細(xì)胞-細(xì)胞界面處的兩個獨立的CD28或ICOS二聚體的二價結(jié)合,。二聚體B7-1配體與相鄰的CD28或ICOS受體二聚體橋接的親合力作用有助于穩(wěn)定配體-受體相互作用,，導(dǎo)致受體超聚體的形成，隨后誘導(dǎo)更有效的共刺激受體信號傳導(dǎo),。另外,，T細(xì)胞活化后免疫突觸內(nèi)的CD28和ICOS受體的隔離可能進一步有助于受體超聚體的形成，并且由于與鄰近受體更加靠近,，也有助于響應(yīng)B7配體結(jié)合時共刺激受體信號有效地傳導(dǎo),。B7配體與CD28和ICOS的二價關(guān)聯(lián)表明，針對這些受體的激動劑抗體必須模擬這種橋接活性以實現(xiàn)最佳受體超聚體的形成和活化,。

圖3：B7-CD28超家族成員的結(jié)構(gòu)示意圖³

CD28和ICOS對T細(xì)胞增殖,、功能和存活的影響是非冗余的。雖然結(jié)合配體后CD28和ICOS都能激活磷酸肌醇3-激酶（PI3K）信號通路和活化T細(xì)胞核因子（NFAT）信號通路,，但是CD28的獨特之處在于它還能顯著誘導(dǎo)JNK和NF-κB信號傳導(dǎo),。CD28和ICOS可以將PI3K的調(diào)節(jié)亞基募集到其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的膜近端YXXM基序，然而ICOS的YMFM基序能比CD28的YMNM基序誘導(dǎo)更強的PI3K信號傳導(dǎo),，PI3K隨后驅(qū)動AKT的磷酸化激活以及NFAT的激活,。

此外，CD28膜遠(yuǎn)端含有富含脯氨酸的基序,，這些基序可與含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相互作用,，如生長因子受體結(jié)合蛋白2（GRB2）和淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶（LCK），它們可通過NF-κB,、JNK和AP1（銜接蛋白1）復(fù)合物介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),。

盡管TNFR家族執(zhí)行了廣泛的生物學(xué)功能，但受體和配體的結(jié)構(gòu)以及結(jié)合和信號傳導(dǎo)的機制在家庭成員之間通常是保守的,。然而,，就序列和三級結(jié)構(gòu)而言，六種TNFR共刺激配體（CD40L,、OX40L,、4-1BBL、GITRL,、CD70和CD30L）是TNF超家族配體中最不同的,。與大多數(shù)其它家族成員的經(jīng)典鐘形三聚體相比,，TNF共刺激配體可以有獨特的三級構(gòu)象。盡管一些TNF配體作為可溶性蛋白產(chǎn)生或被蛋白酶切割釋放以充當(dāng)可溶性配體,，但是六種免疫共刺激性TNFR的配體都不是以可溶形式起作用的,。已經(jīng)提出了許多關(guān)于TNF配體如何激活共刺激受體信號的機制。一種機制是三聚體TNF配體協(xié)調(diào)三種單體TNFR結(jié)合成3:3構(gòu)型,。然而,，即使在沒有配體的情況下，一些TNFR主要以預(yù)先形成的三聚體構(gòu)型存在,。在這種情況下,，TNF配體結(jié)合可導(dǎo)致預(yù)先形成的三聚體受體的構(gòu)象變化，導(dǎo)致胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),。第三個模型是TNF配體三聚體橋接多個預(yù)先形成的受體三聚體復(fù)合物,，導(dǎo)致受體超聚體的形成或者預(yù)先形成的配體超聚體可以結(jié)合和介導(dǎo)受體超聚體的形成，這種模型似乎與功能觀察更為相符,。多個證據(jù)表明受體超聚集是介導(dǎo)TNF共刺激受體高效信號誘導(dǎo)的重要因素。研究發(fā)現(xiàn),，與膜結(jié)合形式相比,，一些可溶性TNF配體的激動劑潛力在可溶形式“僅三聚體構(gòu)型”中顯著降低，然而無活性的可溶性配體形式可通過形成能夠誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)的高級寡聚體（含有三個以上的單體）而獲得活性,。同樣用GITRL和CD40L也得到了類似的結(jié)論,。GITRL和CD40L可能存在二聚體、三聚體和更高級寡聚體并且增加的激動劑活性與配體的高級寡聚形式強烈相關(guān),。

天然TNF配體-受體相互作用的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系表明靶向共刺激性TNFR的激動劑抗體必須能夠誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)所需的共刺激受體的更高級寡聚化（超聚集）,。因此與靶向B7-CD28家族的抗體非常相似，多價結(jié)合和誘導(dǎo)受體超聚集的潛力是最佳激動劑活性的關(guān)鍵要素,。與主要通過NFAT轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的CD28和ICOS不同的是,，共刺激性TNFR主要驅(qū)動NF-κB信號傳導(dǎo)。共刺激性TNFR通過與六種已知的TNFR相關(guān)因子（TRAF）家族成員的差異相互作用激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo),，每種家族成員具有不同的表達模式和不同的上游和下游介質(zhì),。TRAF2是最廣泛表達的，并且被認(rèn)為能夠與所有六種共刺激性TNFR結(jié)合,。其他的TRAF與不同的共刺激性TNFR結(jié)合,，導(dǎo)致重疊但不同的信號模式。TRAF主要通過激活NF-κB抑制劑（IκB）激酶IKK介導(dǎo)NF-κB信號,。IκB的磷酸化和降解導(dǎo)致NF-κB易位至細(xì)胞核以激活轉(zhuǎn)錄,。某些TRAF，如TRAF6,，還可以通過活化有絲分裂原激活蛋白激酶激酶激酶7（MAP3K7）來介導(dǎo)JNK信號傳導(dǎo),，或者通過激活其他上游的MAP3K反過來激活JNK信號通路⁴,。

決定拮抗劑抗體活性的重要生物物理標(biāo)準(zhǔn)（例如受體結(jié)合表位和親和力）在激動劑的設(shè)計中也是重要的,。然而,，驅(qū)動拮抗劑抗體設(shè)計（高親和力和配體競爭）的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的一般規(guī)則不適用于激動劑抗體設(shè)計。目前表位和親和力在控制激動劑抗體活性中的作用主要在TNFR家族中進行研究,，特別是在靶向TNF死亡受體的激動劑抗體中,。然而，從靶向死亡受體的激動劑中吸取的經(jīng)驗教訓(xùn)也可以應(yīng)用于靶向TNF共刺激受體的激動劑抗體的研究中,。這些規(guī)則如何影響B(tài)7-CD28類的激動劑目前還不太清楚,，但可以推斷這兩類受體與基于驅(qū)動受體超聚集的形成以誘導(dǎo)激動劑功能的一般原理相似。Chodorge等利用噬菌體研究鑒定了靶向TNFRSF6（FAS）的有效激動劑抗體以及具有FAS親和力的四種變體,，并對其進行激動劑潛力測試⁵,。令人驚訝的是，F(xiàn)AS親和力和激動劑活性之間呈現(xiàn)強烈負(fù)相關(guān),，最高親和力的抗體幾乎喪失了所有的激動劑活性,。然而，通過添加蛋白A交聯(lián),，激動劑活性增加至組中所有抗體的相似水平,，消除了親和力對激動劑功能的影響。研究表明存在一種抗體結(jié)合親和力與激動劑功能反向相關(guān)的模型,，而之前也有研究顯示靶向FAS的抗體組能夠結(jié)合相同或相似的表位,，但可以導(dǎo)致不同的生物學(xué)效應(yīng)，其中一些作為激動劑,，另一些作為拮抗劑,。雖然表位不能預(yù)測功能，但相對的結(jié)合親和力確實與FAS的激動劑活性呈負(fù)相關(guān),。這些研究雖然證明親和力對于實現(xiàn)激動劑功能的重要性,，但也清楚地表明單獨的結(jié)合表位并不能決定前者的功能。激動劑抗體通常顯示與其靶受體的配體結(jié)合表位有部分或相當(dāng)程度的重疊,。然而,，也存在激動劑抗體幾乎不與配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域重疊并且結(jié)合受體可以與天然配體完全不同。Bjorck等研究發(fā)現(xiàn)靶向CD40上不同表位的多種抗體能夠引起激動劑信號的激活,。事實上,，有兩種抗體在一起使用時協(xié)同作用CD40信號傳導(dǎo)但在與CD40L組合使用時不協(xié)同作用⁶。在這些情況下,，激動劑抗體在受體活化模式方面可能與天然配體不同,。替代性激動劑作用模式可包括優(yōu)先結(jié)合并穩(wěn)定預(yù)先形成的受體寡聚體（圖4a）。因此，激動劑抗體的受體結(jié)合表位可能是負(fù)責(zé)信號傳導(dǎo)活性的重要因素,。然而對于單個受體來說,，可能存在不止一種能夠?qū)崿F(xiàn)激動劑活性的結(jié)合表位。因此,，孤立的受體結(jié)合表位不能預(yù)測抗體的激動劑潛力,。

抗體誘導(dǎo)受體超聚體形成的能力對于共刺激激動劑功能是至關(guān)重要的。因此,，天然免疫球蛋白G（IgG）的二價是必須保留的關(guān)鍵生物物理特征,。通過兩個抗原結(jié)合片段（Fab）橋接多個受體可導(dǎo)致單體-單體相互作用或更高級（大于兩個）簇的形成，其不同于拮抗劑抗體的是拮抗劑抗體的設(shè)計中單價結(jié)合抗體或抗體片段可以作為有效的拮抗劑,。這種差異對于雙特異性抗體的設(shè)計具有重要意義,。

目前已經(jīng)研發(fā)出IgG樣雙特異性抗體，其中的單個IgG可通過具有不同抗原特異性的兩個Fab臂結(jié)合兩種不同的受體,。這種形式具有同時阻斷兩個軸（拮抗劑-拮抗劑配對）的潛力,，每個拮抗劑Fab與其各自的靶受體形成單價結(jié)合相互作用。不太清楚的是激動劑-拮抗劑或激動劑-激動劑配對是否也可以以這種形式實現(xiàn),。有一些TNFR家族成員能夠形成混合寡聚體轉(zhuǎn)導(dǎo)信號,，與單個共刺激受體的同源二聚化相比，抗體誘導(dǎo)的不同共刺激受體的異二聚化是否可以誘導(dǎo)相似的或協(xié)同的激活也是個有意思的問題,。通過產(chǎn)生針對4-1BB和OX40的激動適配子以及包括CD40L,、4-1BBL和OX40L在內(nèi)的可溶性重組形式的共刺激性TNF配體已經(jīng)證明了多價對于激活共刺激受體的重要性，其中配體融合的高級寡聚體或交聯(lián)三聚體能夠比天然可溶性三聚體形式或單體形式誘導(dǎo)更顯著的TNFR激活,。