1,、基本原理：

一定波長(zhǎng)的激光束直接照射到高壓驅(qū)動(dòng)的液流，產(chǎn)生的光信號(hào)被多個(gè)接收器接受,，一個(gè)是機(jī)關(guān)束直線方向上接受的前向角散射光信號(hào),。其他是在激光束垂直方向上接受的光信號(hào)，包括側(cè)向角散射光信號(hào)和熒光信號(hào),，這些光信號(hào)被相應(yīng)的接受器接受后,，根據(jù)接收信號(hào)的強(qiáng)弱就能反應(yīng)出細(xì)胞的物理和化學(xué)特征。

2,、物理屬性：

前向散射光（forward scatter）

FSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小相關(guān),。

側(cè)向散射光（side scatter）

SSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少相關(guān)。

3,、化學(xué)屬性：

1.熒光信號(hào)是人為通過(guò)不同手段將熒光物質(zhì)結(jié)合在細(xì)胞上,，是人為屬性。

2.熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生,，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)波長(zhǎng)不同；

3.每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色,，通過(guò)波長(zhǎng)選擇通透性濾片,，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi)，送到不同的光電倍增管,。

4,、免疫熒光染色

5,、常見(jiàn)熒光素

根據(jù)激光及濾光片選取流式抗體染料

6、常見(jiàn)的熒光素染料組合

7,、舉例：

8,、雙或多參數(shù)熒光抗體的標(biāo)記組合

1）單染

2）雙或多染

空白對(duì)照（未染色細(xì)胞）：用以區(qū)分細(xì)胞的自發(fā)熒光和特異性熒光,，避免假陽(yáng)性的結(jié)果,。

同型對(duì)照：使用與實(shí)驗(yàn)抗體相同種屬來(lái)源、相同劑量及同種免疫球蛋白的相同亞型的抗體作為對(duì)照,，用于消除抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞上而產(chǎn)生的背景熒光,。

對(duì)于流式樣本,，由于細(xì)胞的自發(fā)熒光、熒光抗體會(huì)與待測(cè)標(biāo)本中的細(xì)胞發(fā)生少量非特異性結(jié)合,，在流式細(xì)胞儀上可檢出一定的信號(hào),，這部分信號(hào)稱為基礎(chǔ)熒光閾值。

在流式標(biāo)本檢測(cè)的過(guò)程中,，通常通過(guò)調(diào)節(jié)電壓將陰性細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值于95%或99%的置信區(qū)間內(nèi),，作為陰性對(duì)照可信區(qū)間設(shè)定。大于陰性置信區(qū)間的熒光信號(hào)為特異性熒光信號(hào),。

注意：流式圖中的顏色為區(qū)分不同細(xì)胞群而人為設(shè)定,，與熒光無(wú)關(guān)

1）紅色線：空白對(duì)照；

2）綠色線：陰性（同型）對(duì)照,，（P2區(qū)域即為陰性區(qū)域）

3）藍(lán)色線為實(shí)驗(yàn)組,。

1、單參數(shù)直方圖

以分布直方圖來(lái)顯示,，橫軸為該參數(shù)測(cè)量強(qiáng)度的相對(duì)值,，單位是道數(shù)，可以是線形或者對(duì)數(shù),?？v軸一般是相對(duì)細(xì)胞/粒子數(shù)。

橫軸：參數(shù)測(cè)量強(qiáng)度的相對(duì)值,；

縱軸：相對(duì)細(xì)胞（粒子）數(shù)

細(xì)胞DNA含量的檢測(cè)（細(xì)胞周期分析）

2,、二維散點(diǎn)圖

能夠顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對(duì)數(shù)之間的關(guān)系，橫,、縱坐標(biāo)分別代表兩個(gè)獨(dú)立參數(shù),，平面上每一個(gè)點(diǎn)表示具有相應(yīng)坐標(biāo)值的細(xì)胞。

3、二維等高線圖

用等高線來(lái)代表細(xì)胞數(shù),，在一條等高線上的細(xì)胞數(shù)相同,，不同的等高線細(xì)胞數(shù)不同。

4,、假三維圖

縱軸與橫軸分別代表被測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù),，Z軸為細(xì)胞數(shù)。

5,、三維圖

任意選三個(gè)參數(shù)為X,Y,Z軸,，構(gòu)成一個(gè)三維圖，每一群細(xì)胞根據(jù)各自參數(shù)處于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的空間,，三維圖對(duì)比較復(fù)制的亞群的顯示更為直觀明了,。

6、設(shè)門

FCM數(shù)據(jù)分析的目的是通過(guò)與適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照進(jìn)行比較,，來(lái)確定所分析樣本中表達(dá)標(biāo)記物的細(xì)胞百分率,。完成這一過(guò)程的第一步就是需要確定我們所要研究的目的細(xì)胞群，其術(shù)語(yǔ)為設(shè)門,。

設(shè)門是指在細(xì)胞分布圖中指定某一個(gè)范圍或某一細(xì)胞性狀的細(xì)胞群,，并對(duì)其進(jìn)行單參數(shù)或多參數(shù)分析。

根據(jù)門的形狀分為：線性門,、矩形門,、圓形門、多邊形門,、任意形狀門和十字門,。

通過(guò)FSC/SSC散點(diǎn)圖，設(shè)門（gata）得到目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分析,。

舉例：比較A地和B地黃皮膚黑頭發(fā)的年輕男性的比例,？

門（Gata）設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群,，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況,。

1、測(cè)腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)水平,，活細(xì)胞獲取

2,、檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)水平

關(guān)于A/W/H的說(shuō)明：

1）信號(hào)檢測(cè)時(shí)，每一個(gè)細(xì)胞通過(guò)激光,，機(jī)器的探頭都會(huì)檢測(cè)到一個(gè)熒光信號(hào),，在內(nèi)部產(chǎn)生一個(gè)電脈沖信號(hào)（波），這個(gè)信號(hào)機(jī)器記錄為一個(gè)峰值,，每一個(gè)峰值都有三個(gè)參數(shù),，高度（H）,，寬度（W）和曲線下面積（A）,，H 和W都是直接測(cè)出的,，而A是根據(jù)機(jī)器的設(shè)置就算得出。

2）臨床和科研中使用A的時(shí)候比較多,，特別在DNA倍體測(cè)定時(shí)一定要使用A,，此外做熒光分辨率、熒光靈敏度等性能測(cè)試時(shí)也使用A,。不過(guò)臨床應(yīng)用中的一些實(shí)驗(yàn)也顯示,，使用H時(shí)具有更高的CV和分離度，對(duì)于弱熒光細(xì)胞的辨識(shí)是有優(yōu)勢(shì)的,，因此選用H也是可以的,。

看圖技巧：

1、先看橫,、縱坐標(biāo),，了解檢測(cè)目的；

2,、看圖形分布,，直方圖峰型越往右移，代表其熒光強(qiáng)度越強(qiáng),；

3,、M1的確定是根據(jù)陰性對(duì)照細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光域值設(shè)定的，峰形右移,，熒光信號(hào)大于基礎(chǔ)熒光域值（M1）,，表示陽(yáng)性（M2）；

4,、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí),，檢測(cè)目的物一般用各Marker區(qū)內(nèi)的細(xì)胞所占百分比或者用平均熒光強(qiáng)度表示；

5,、幾個(gè)直方圖的比較,，關(guān)鍵看Mark（M1,M2）的位置以及細(xì)胞數(shù)。

比較不同細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)水平。

1、細(xì)胞增殖檢測(cè)

CellTrace細(xì)胞增殖試劑盒含有細(xì)胞膜通透性非熒光酯，可通過(guò)擴(kuò)散透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,，并與胺基反應(yīng)形成熒光分子。這種無(wú)熒光的酯進(jìn)入細(xì)胞后,，可被細(xì)胞內(nèi)酯酶轉(zhuǎn)化為熒光產(chǎn)物,?；罨溺陙啺孵ヅc蛋白質(zhì)中的胺基基團(tuán)共價(jià)結(jié)合,，使染料能夠長(zhǎng)時(shí)間保留在細(xì)胞中。

隨著分裂,，熒光越弱

2、細(xì)胞周期檢測(cè)

處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞DNA含量不同,，G0/G1期細(xì)胞含有二倍體量的DNA,， G2/M期細(xì)胞含有四倍體量的DNA,，而S期細(xì)胞的DNA含量處于二倍體和四倍體量之間,。

DNA熒光染料能與DNA結(jié)合,，DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比,，熒光強(qiáng)度反應(yīng)了DNA吸收熒光分子的多少,。通過(guò)流式檢測(cè)就能反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)DNA的含量，區(qū)別細(xì)胞周期的G0/G1,、 S期和,， G2/M期細(xì)胞的比例。

3、細(xì)胞周期分析核酸染料

細(xì)胞膜非通透性染料：PI（碘化丙叮）,、EB（溴化乙啶），不能進(jìn)入完整細(xì)胞膜,，標(biāo)記時(shí)需要通過(guò)固定等方法增加細(xì)胞膜的通透性,。

細(xì)胞膜通透性染料：Hoechst,、DAPI等能染活細(xì)胞的DNA,，但需紫外激光激發(fā)。

4、增殖及細(xì)胞周期

增殖相關(guān)Mark:Ki67,，Brdu,，MCM2,PCNA。

5、Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

正常細(xì)胞膜是不對(duì)稱的,，胞漿面含有帶負(fù)電的磷脂（磷脂酰絲氨酸,，PS）。早期凋亡時(shí),，細(xì)胞表面不對(duì)稱性發(fā)生改變,，PS外翻到胞外側(cè)。

Annexin V是一種鈣離子依賴的對(duì)PS有高度親和力的磷脂結(jié)合蛋白,，可作為探針識(shí)別膜表面是否有PS,，從而識(shí)別凋亡細(xì)胞。

PI常用于鑒別死細(xì)胞,。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然是完整的,，所以PI不能進(jìn)入早期凋亡細(xì)胞核內(nèi)。

Annexin V:識(shí)別凋亡細(xì)胞

PI：識(shí)別死細(xì)胞

6,、Caspase-3法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

7,、PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

凋亡的細(xì)胞由于DNA 裂解成許多小片段， 小分子量的 DNA 片段穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入乙醇溶液中造成流失,，僅剩下大片段的 DNA,，最終導(dǎo)致凋亡細(xì)胞內(nèi) DNA 含量減少。經(jīng) DNA 熒光染料碘化丙啶(PI)染色后熒光強(qiáng)度明顯減小,，形成一個(gè) DNA 含量小于 2n(即 G1 期細(xì)胞) 的分布區(qū),， 稱為亞“G1”峰,。

1、淋巴細(xì)胞分選

2,、案例分析：總結(jié)