RNA甲基化的綜合分析揭示了其在3’UTR和近終止密碼子處富集

Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3' UTRs and Near Stop Codons

眾所周知,，基因組DNA和組蛋白上存在可逆的表觀遺傳修飾,，這些修飾可調(diào)控基因的表達(dá)，并由此決定細(xì)胞的狀態(tài),，影響細(xì)胞的分化和發(fā)育,。近年來(lái)人們又發(fā)現(xiàn)，除了傳統(tǒng)表觀遺傳修飾外,，mRNA和其它RNA上也存在這一類(lèi)修飾,，發(fā)揮著固定的生理學(xué)功能。RNA甲基化在近幾年成為研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),。

RNA甲基化（RNA methylation）是一類(lèi)新認(rèn)知的表觀遺傳修飾,，在真核生物中主要包括 6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）和 5-甲基胞嘧啶（C5-methylcytidine,，m5C）兩類(lèi) RNA 轉(zhuǎn)錄后修飾,。

2012年發(fā)表在CELL雜志上的文獻(xiàn)（Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3' UTRs and Near Stop Codons）闡述了mRNA甲基化(m6A)在3’UTR和近終止密碼子富集。

Abstract

肥胖風(fēng)險(xiǎn)基因FTO編碼m6A去甲基化酶,，表明m6A是生理過(guò)程的重要調(diào)控因子,。在此，本文提出了一種全轉(zhuǎn)錄組m6A定位的方法，該方法結(jié)合了m6A特異性甲基化RNA免疫沉淀和下一代測(cè)序(MeRIP-Seq),。然后利用該方法對(duì)7676個(gè)哺乳動(dòng)物基因中含有m6A的mRNA進(jìn)行了鑒定,，表明m6A是一種常見(jiàn)的mRNA堿基修飾。m6A修飾表現(xiàn)出組織特異性調(diào)節(jié),，并在整個(gè)大腦發(fā)育過(guò)程中顯著增加,。并且本文發(fā)現(xiàn)m6A位點(diǎn)在3' UTRs和終止密碼子附近富集，并發(fā)現(xiàn)了m6A殘基與3' UTRs內(nèi)microRNA結(jié)合位點(diǎn)之間的聯(lián)系,。這些發(fā)現(xiàn)為識(shí)別腺苷甲基化的底物轉(zhuǎn)錄本提供了資源,，并揭示了哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組表觀遺傳調(diào)控的見(jiàn)解。

文章主要得到了以下幾個(gè)結(jié)果：

1. 哺乳動(dòng)物mRNA中m6A的檢測(cè)

由于m6A與未修飾的腺苷具有相同的堿基配對(duì),，因此無(wú)法通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序或基于雜交的方法檢測(cè)到,。另外，m6A不易受化學(xué)修飾的影響,，否則可能促進(jìn)其檢測(cè),，例如用于檢測(cè)DNA中5mC的亞硫酸氫鹽處理。迄今為止用于檢測(cè)m6A的方法為用放射性標(biāo)記的甲硫氨酸處理細(xì)胞,，隨后用薄層色譜或HPLC繪制放射性標(biāo)記的m6A殘基,。為了簡(jiǎn)化m6A的檢測(cè)，我們尋求開(kāi)發(fā)免疫印跡策略,。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn),，作者使用m6A抗體。為了確保該抗體對(duì)m6A的特異性,，作者使用固定在膜上的修飾寡核苷酸進(jìn)行斑點(diǎn)印跡,。m6A抗體選擇性地與含有單個(gè)m6A殘基的寡核苷酸結(jié)合，并且與含有未修飾的腺苷的寡核苷酸的結(jié)合可忽略不計(jì),，通過(guò)將抗體與增加濃度的富含m6A的競(jìng)爭(zhēng)物RNA一起培育來(lái)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,，然而，含有未修飾的腺苷的RNA不競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,。如下圖所示：

為了探索各種RNA群體中m6A的豐度,，我們從幾個(gè)小鼠組織中分離RNA，并使用m6A抗體進(jìn)行免疫印跡分析,。我們發(fā)現(xiàn)m6A存在于所有測(cè)試的RNA樣本中,，表明這種修飾的核苷酸廣泛分布在許多組織中，在肝,，腎和腦中具有特別高的富集,。如下圖所示：

此外,，我們觀察到各種永生細(xì)胞系（包括幾種癌細(xì)胞系）的m6A含量存在巨大差異,，這進(jìn)一步表明不同細(xì)胞群中存在m6A水平的巨大差異。

為了確定m6A是否存在于poly（A）尾部，我們使用oligo（dT）雜交和RNase H處理從細(xì)胞mRNA中選擇性地去除poly（A）尾巴,。缺少poly（A）尾的轉(zhuǎn)錄物沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的m6A水平降低,，此外，單獨(dú)的免疫印跡poly（A）尾部顯示出最小的m6A免疫反應(yīng)性,?？傊@些數(shù)據(jù)表明m6A主要是內(nèi)部修飾,，其在poly（A）尾部基本上不存在,。如下圖所示：

2. m6A的動(dòng)態(tài)調(diào)控

本文觀察到m6A在大腦內(nèi)高度富集，這促使作者研究神經(jīng)發(fā)育不同階段m6A水平的時(shí)間動(dòng)態(tài),。用m6A抗體免疫印跡RNA樣品表明m6A在胚胎發(fā)生過(guò)程中以低水平存在于mRNA中,，但在成年期顯著增加。如下圖所示：

另外,，作者觀察到FTO在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)降低了m6A水平,，并且發(fā)現(xiàn)FTO的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致大范圍的RNA表現(xiàn)出降低的m6A免疫反應(yīng)性。如下圖所示：

結(jié)果3. MeRIP-Seq在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組中識(shí)別含有m6A的RNA

為了識(shí)別整個(gè)轉(zhuǎn)錄組中的m6A位點(diǎn),，我們開(kāi)發(fā)了一種方法,，該方法將m6A特異性甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）與下一代測(cè)序（RNA-Seq）相結(jié)合。 MeRIP-Seq的方法涉及在免疫沉淀之前將RNA隨機(jī)片段化為約100個(gè)大小的片段,，如下圖所示：

因?yàn)閙6A位點(diǎn)可位于給定免疫沉淀的100nt片段長(zhǎng)度的任何位置,，所以預(yù)期測(cè)序reads將映射到其中心附近含有m6A位點(diǎn)的區(qū)域。在極端情況下,，預(yù)計(jì)該區(qū)域大約200 nt寬,。接下來(lái)利用MeRIP-Seq識(shí)別總小鼠腦RNA中的m6A位點(diǎn)。 從經(jīng)常映射到mRNA的MeRIP樣本中讀取并聚集為不同的峰,。正如預(yù)測(cè)的那樣,，這些峰值經(jīng)常會(huì)聚到靠近中點(diǎn)的大約100 nt寬的區(qū)域，如下圖所示：

結(jié)果4 在非編碼rna中檢測(cè)到m6A

本文發(fā)現(xiàn)m6A高峰(94.5%)主要是在mRNA中發(fā)現(xiàn)的,。然而,，作者也觀察到，236個(gè)峰值(1.1%)映射到在RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)注的非編碼Rna上,。此外,，588個(gè)m6A峰沒(méi)有與已知的RefSeq mRNA或ncRNA相對(duì)應(yīng)。為了確定這些未加注釋的峰值是否定位于其他數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)的ncRNA,，我們將它們與哺乳動(dòng)物非編碼RNA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的小鼠(FANTOM3) RIKEN功能注釋數(shù)據(jù)集的一組32,211個(gè)ncrna的基因組區(qū)域進(jìn)行比對(duì),，作者發(fā)現(xiàn)其中216個(gè)峰映射到FANTOM3 ncRNA。這些ncrna的長(zhǎng)度均大于200 nt,，說(shuō)明長(zhǎng)ncrna是腺苷甲基化的底物,。

結(jié)果5含m6a轉(zhuǎn)錄本的生化驗(yàn)證

作者接下來(lái)試圖驗(yàn)證在經(jīng)MeRIP-Seq鑒定的mRNA中是否存在m6A,。為此，我們使用RNA pull-down實(shí)驗(yàn),，通過(guò)與目標(biāo)特異性探針雜交,，從小鼠大腦總RNA中分離出單個(gè)mRNA。分離出的mRNA使用m6A抗體進(jìn)行免疫印跡分析,，檢測(cè)m6A的存在,。利用該方法，我們驗(yàn)證了低密度脂蛋白受體(Ldlr)中m6A的存在,。如下圖所示：

結(jié)果6 包含m6a的mRNA參與重要的生物學(xué)通路

為了預(yù)測(cè)m6A的潛在信號(hào)通路和細(xì)胞過(guò)程,，我們使用DAVID來(lái)識(shí)別富含m6A轉(zhuǎn)錄本的GO功能。我們發(fā)現(xiàn)編碼含m6a RNA的基因參與了多種細(xì)胞功能,，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控,、RNA代謝和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)。此外,，我們觀察到m6A峰值映射到許多與神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)障礙相關(guān)的基因,，如Bdnf、Dscam,、Lis1,、Ube3a，以及神經(jīng)新生素和一些神經(jīng)配體,?？傊@些數(shù)據(jù)表明,，含有m6a的RNA參與了與細(xì)胞信號(hào)和疾病相關(guān)的多種生物學(xué)通路,。

結(jié)果7不同模式的m6A位于轉(zhuǎn)錄本

作者又研究了mRNA中腺苷甲基化的模式。來(lái)自許多基因的mRNA(46.0%)顯示一個(gè)m6A峰,，與一個(gè)m6A位點(diǎn)或一簇相鄰的m6A殘基一致,。然而，37.3%包含兩個(gè)m6A峰,，11.2%包含三個(gè)峰,，5.5%包含四個(gè)或更多峰。幾個(gè)基因包含10個(gè)或更多的m6A峰,，表明在其長(zhǎng)度上存在多個(gè)m6A殘基,。事實(shí)上，在20個(gè)表現(xiàn)出最多m6A峰的基因中,，所有的基因在其長(zhǎng)度上都有15個(gè)或更多的m6A峰,。此外，在包含一個(gè)以上m6A峰的基因中,，90.1%包含兩個(gè)或兩個(gè)以上相鄰的m6A峰,，這表明m6A位點(diǎn)經(jīng)常沿著轉(zhuǎn)錄本聚集在相鄰區(qū)域,。接下來(lái)作者確定哪些mRNA含有甲基化程度最高的m6A位點(diǎn), 為此，作者開(kāi)發(fā)了一種計(jì)算單個(gè)m6A峰處m6A富集水平的方法,，該方法將每個(gè)峰內(nèi)MeRIP樣本讀取的數(shù)量歸一化為該峰所在的單個(gè)轉(zhuǎn)錄本的豐度,。因此,，局部m6A富集水平最高的峰可能代表一個(gè)具有高度甲基化的腺苷殘基,，或者多個(gè)甲基化程度較低的相鄰m6A殘基。然而,，在這兩種情況下,，在這些位點(diǎn)觀察到的高甲基化可能表明轉(zhuǎn)錄本受m6a依賴(lài)性調(diào)節(jié)過(guò)程的影響最大。

結(jié)果8 m6A在終止密碼子附近和mRNA的3 ' UTRs中富集

接下來(lái)作者研究了轉(zhuǎn)錄組區(qū)域內(nèi)m6A峰的分布,。大多數(shù)(94.8%)m6A峰發(fā)生在基因內(nèi)的區(qū)域,。這些m6A峰主要富集在編碼區(qū)(cd;50.9%)和非翻譯區(qū)(UTRs;41.9%)，內(nèi)含子區(qū)相對(duì)較少(2.0%),。此外,，在5 ' UTR(7.0%)中m6A峰的數(shù)量也少于3 ' UTR(93.0%)。雖然內(nèi)含子區(qū)域中m6A峰的百分比較低,，但由于樣品未富集未剪接的pre-mrna,，因此可能存在額外的甲基化內(nèi)含子序列。如下圖所示：

并且,，研究發(fā)現(xiàn),，m6A在編碼區(qū)的5 ' UTR和5 '端處于低水平。在編碼區(qū)中,，m6A的百分比隨著轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度的增加而穩(wěn)步上升,，在編碼區(qū)結(jié)束時(shí)比開(kāi)始時(shí)高出5-6倍。在3 ' UTR中,，峰值在終止密碼子附近富集,，并沿3 ' UTR長(zhǎng)度富集遞減?？偟膩?lái)說(shuō),，這些數(shù)據(jù)表明m6A峰高度聚集在mRNA的停止密碼子附近。如下圖所示：

結(jié)果9 m6A發(fā)生在具有獨(dú)特序列的高保守的區(qū)域內(nèi)

接下來(lái)我們研究m6A位點(diǎn)是否在物種間保守,。我們比較了30種脊椎動(dòng)物m6A峰區(qū)域的PhyloP評(píng)分與基因外顯子大小相同的隨機(jī)區(qū)域的評(píng)分,。我們發(fā)現(xiàn)保守m6A峰的分?jǐn)?shù)的分布明顯不同于隨機(jī)區(qū)域,m6A高峰值保守得分遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于隨機(jī)區(qū)域。m6A經(jīng)常發(fā)生在進(jìn)化保守序列中,，這一事實(shí)表明,，包含m6A的區(qū)域是通過(guò)選擇壓力維持的。如下圖所示：

然后,，作者試圖識(shí)別m6A峰內(nèi)富集的序列基序,。為了做到這一點(diǎn),，我們使用了FIRE，這是一種發(fā)現(xiàn)RNA調(diào)控元件的敏感且無(wú)偏的工具,。值得注意的是,，F(xiàn)IRE獨(dú)立識(shí)別了GAC和AAC motif、G[AG]ACU以及相關(guān)變體([AC]GAC[GU],、GGAC,、[AU][CG]G[AG]AC和UGAC)在m6A峰中高度富集。如下圖所示：

接下來(lái)作者研究了這些基序在m6A峰中的位置,。近30%的m6A峰只有一個(gè)motif,，表明這些峰可能只含有一個(gè)甲基化殘基。在m6A峰的中心也優(yōu)先發(fā)現(xiàn)基序,，說(shuō)明這些峰值來(lái)自于一個(gè)位于中心的甲基化腺苷殘基,。值得注意的是，其他RNA調(diào)控元件,，如富AU元件,、poly(A)信號(hào)或已知RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，均未被FIRE識(shí)別,，這表明m6A不太可能主要通過(guò)修飾這些已知的調(diào)控元件發(fā)揮作用,。如下圖所示：

結(jié)果10 m6A在剪接接頭處不富集

另外，研究發(fā)現(xiàn),，m6A峰與外顯子-外顯子連接處沒(méi)有明顯重合,，說(shuō)明m6A不太可能直接影響剪接因子的結(jié)合。

結(jié)果11 m6A與3’UTRs內(nèi)MicroRNA結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)系

3’UTRs中m6A峰的強(qiáng)烈富集促使作者研究m6A峰是否在microRNA (miRNA)結(jié)合位點(diǎn)附近發(fā)生,。作者發(fā)現(xiàn),，含有m6A峰值的3 ' UTR中，67%也包含至少一個(gè)靶向預(yù)測(cè)的miRNA結(jié)合位點(diǎn),。此外,，作者發(fā)現(xiàn)3’UTRs內(nèi)m6A峰的整體分布與miRNA結(jié)合位點(diǎn)呈反相關(guān)。雖然m6A峰值在停止密碼子附近最為豐富,，且通常沿3 ' UTR長(zhǎng)度頻率降低,，但miRNA靶位點(diǎn)在3 ' UTRs的3 ' 尾端附近更為豐富。如下圖所示：

接下來(lái),，作者試圖確定大腦中針對(duì)mirna的轉(zhuǎn)錄本是否更有可能包含m6A,。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們使用TargetScan來(lái)識(shí)別大腦中25個(gè)高表達(dá)mirna和25個(gè)低表達(dá)mirna的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本,。有趣的是,，我們發(fā)現(xiàn)最高表達(dá)的mirna在包含m6A的靶轉(zhuǎn)錄本中所占的比例要大得多。這些數(shù)據(jù)表明miRNA水平可能控制其靶轉(zhuǎn)錄本的甲基化,。如下圖所示：

結(jié)果12 m6A分布的顯著特征在人類(lèi)轉(zhuǎn)錄組中是保守的

為了探究其他物種中是否也觀察到m6A在3 ' UTR中的富集,。因此,，我們?cè)贖EK293T細(xì)胞中分析了m6A，這是一個(gè)具有高水平腺苷甲基化的人類(lèi)細(xì)胞系,。作者使用三次MeRIP-Seq生成了一個(gè)m6A高峰的高置信度列表,，并得到了兩種m6A抗體的證實(shí)。我們發(fā)現(xiàn),，在HEK293T細(xì)胞中m6A峰的分布與小鼠大腦中m6A峰的分布非常接近,，分別有31%和53%的m6A峰位于3 ' UTR和CDS中。與m6A在小鼠大腦轉(zhuǎn)錄組的分布模式一樣,，HEK293T m6A的峰值主要分布在終止密碼子附近,。如下圖所示：

綜上所述,，這些數(shù)據(jù)表明,，在人類(lèi)轉(zhuǎn)錄本的終止密碼子附近m6A峰大量富集，在小鼠和人類(lèi)轉(zhuǎn)錄本中,，許多甲基化位點(diǎn)是保守的,。