Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與胚胎形成,、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài),、哺乳細(xì)胞的增殖和分化等生理過(guò)程。正常情況下,，在胞漿中β-catenin的絲/蘇氨酸位點(diǎn)被糖原合成酶激酶（GSK-3β）磷酸化,，接著磷酸化的β-catenin通過(guò)泛素蛋白酶體途徑降解。如果Wnt信號(hào)活化,，β-catenin的磷酸化水平則降低,，蛋白穩(wěn)定性增加并在胞漿中積累，隨之異位入核，與TCF和淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子相互作用,，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),。Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化和β-catenin的核內(nèi)積累的情況發(fā)生在很多腫瘤類型中，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因,。但是腫瘤中調(diào)節(jié)β-catenin活化的機(jī)制還是有待明確的,。

circRNA一般是來(lái)源于母系基因的內(nèi)含子或者外顯子，在結(jié)構(gòu)上屬于共價(jià)閉合的環(huán)狀RNA,。circRNAs具有作為miRNA的sponge,，可結(jié)合蛋白，可翻譯蛋白等功能,。circRNAs作為miRNA的sponge,，這是一種反式trans調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方式，同時(shí)也是大多數(shù)研究報(bào)道的最常見(jiàn)的調(diào)控機(jī)制,，但circRNA還有可能順式作用方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá),。在大多數(shù)腫瘤類型，如肝癌,、前列腺癌和直腸癌中存在表達(dá)失調(diào)的circRNAs,。但是以順式作用方式發(fā)揮功能的circRNAs是否會(huì)影響β-catenin活化和腫瘤發(fā)展，也是有待進(jìn)一步探究,。

順式作用元件(cis-acting element)存在于基因旁側(cè)序列中能影響基因表達(dá)的序列。順式作用元件包括啟動(dòng)子,、增強(qiáng)子,、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件等，它們的作用是參與基因表達(dá)的調(diào)控,。順式作用元件本身不編碼任何蛋白質(zhì),，僅僅提供一個(gè)作用位點(diǎn)，要與反式作用因子相互作用而起作用,。順式作用元件是指與結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)的特定DNA序列,，是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，它們通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的精確起始和轉(zhuǎn)錄效率,。順式作用元件在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域,，相對(duì)同一染色體或DNA分子而言為“順式”（cis）；對(duì)不同染色體或DNA分子而言為“反式”（trans）,。

最近華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院的童強(qiáng)松研究團(tuán)隊(duì)于Cancer Research上在線發(fā)表了題為'Cis-acting circ-CTNNB1 promotes β-catenin signaling and cancer progression via DDX3-mediated transactivation of YY1'的研究,，發(fā)現(xiàn)編碼β-catenin蛋白的ctnnb1基因來(lái)源的circ-CTNNB1結(jié)合DDX3，促進(jìn)其與轉(zhuǎn)錄因子YY1的相互作用,，從而導(dǎo)致YY1的反式活化,，以及促進(jìn)下游與β-catenin活化和腫瘤發(fā)展有關(guān)的基因表達(dá)。敲低circ-CTNNB1表達(dá)或者應(yīng)用阻斷circ-CTNNB1-DDX3相互結(jié)合的抑制肽可以明顯地抑制致癌基因的表達(dá)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展，這首次揭示了circ-CTNNB1的致癌作用以及其可能作為未來(lái)腫瘤治療的有效靶點(diǎn),。

1. 作者通過(guò)圖1A的方法篩選出CTNNB1基因來(lái)源的順式作用的circRNA——circ-CTNNB1,，其在胃癌、前列腺癌和直腸癌中表達(dá)上調(diào),，敲低circ-CTNNB1表達(dá)可以降低胃癌細(xì)胞AGS中β-catenin的活性,。大小為378nt的circ-CTNNB1實(shí)際來(lái)源于CTNNB1基因的10號(hào)內(nèi)含子，而且耐受RNase R的消化降解,，可在大多數(shù)腫瘤中檢測(cè)到circ-CTNNB1的高表達(dá),，在發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤中circ-CTNNB1的表達(dá)水平更高，進(jìn)一步分析顯示circ-CTNNB1的高表達(dá)與臨床病人的存活率低高度相關(guān),。

2. circ-CTNNB1的gain or loss of function實(shí)驗(yàn)——體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：接著作者分別在不同類型腫瘤細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)或者敲低circ-CTNNB1后,，發(fā)現(xiàn)其可以分別促進(jìn)或者抑制細(xì)胞存活能力、克隆形成能力和侵襲能力,；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：過(guò)表達(dá)或者敲低circ-CTNNB1的癌細(xì)胞相應(yīng)地,，在體內(nèi)成瘤能力增強(qiáng)或者降低，瘤子體積明顯增大或者減小,，Ki67增殖指數(shù)變大或者變小,，CD31陽(yáng)性瘤內(nèi)微血管形成能力增強(qiáng)或者減弱；在體內(nèi)尾靜脈注射癌細(xì)胞后觀察肺轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)中,，過(guò)表達(dá)或者敲低circ-CTNNB1可以明顯促進(jìn)或者抑制其發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,，導(dǎo)致相應(yīng)的降低或者提高小鼠存活率的情況。(PS: 本文的circ-CTNNB1過(guò)表達(dá)載體采用的是吉賽生物的pLCDH-ciR 載體,，可轉(zhuǎn)染細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá),，也可包裝慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系，同時(shí)表達(dá)GFP熒光和 Puromycin抗性基因,，可以方便地進(jìn)行篩選,，同時(shí)具有過(guò)表達(dá)效率高、穩(wěn)定性高和序列環(huán)化準(zhǔn)確等特點(diǎn),。)

3. 為了解釋circ-CTNNB1的致癌機(jī)制,，作者首先探究了其對(duì)母系基因CTNNB1表達(dá)的影響。在不同類型腫瘤細(xì)胞中,，過(guò)表達(dá)或者敲低circ-CTNNB1表達(dá)可以明顯上調(diào)或者抑制β-catenin的蛋白表達(dá),，但并不影響CTNNB1的啟動(dòng)子活性或者轉(zhuǎn)錄mRNA水平。而且過(guò)表達(dá)circ-CTNNB1可以同時(shí)上調(diào)胞漿和胞核中β-catenin的表達(dá)水平,；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),，過(guò)表達(dá)或者敲低circ-CTNNB1表達(dá)可以明顯上調(diào)或者抑制β-catenin活性，還可以相應(yīng)地部分抵消Wnt信號(hào)通路抑制劑（XAV939）或者激活劑（WNT3a）的效應(yīng),。WB實(shí)驗(yàn)證明過(guò)表達(dá)circ-CTNNB1上調(diào)β-catenin的蛋白水平主要是因?yàn)槠浣档土甩?catenin蛋白的磷酸化水平,，抑制了其通過(guò)泛素化蛋白酶體途徑降解，從而促進(jìn)其下游靶基因c-Myc和cyclin D1的蛋白表達(dá)；另一方面敲低circ-CTNNB1表達(dá)上調(diào)了β-catenin蛋白的磷酸化水平,，該效應(yīng)可以被WNT3a和GSK-3β抑制劑——LiCl部分抵消,。這些結(jié)果提示circ-CTNNB1促進(jìn)β-catenin的表達(dá)。

4. circ-CTNNB1發(fā)揮功能需要借助什么蛋白partners,？RNA-FISH和亞細(xì)胞組份分析證明circ-CTNNB1主要定位于胞核中,，借助特異性biotin標(biāo)記的circ-CTNNB1進(jìn)行RNA pull-down蛋白復(fù)合物后再質(zhì)譜分析蛋白的實(shí)驗(yàn)，結(jié)合兩種細(xì)胞株的結(jié)果和RBPs數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出了三種RBPs蛋白,，體外再次利用biotin標(biāo)記的RNA pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)行二次驗(yàn)證,，發(fā)現(xiàn)只有DDX3可以與circ-CTNNB1結(jié)合，并呈現(xiàn)劑量依賴性,；同樣地,，RNA-FISH、RIP和RNA-EMSA實(shí)驗(yàn)均證明了circ-CTNNB1與DDX3相互結(jié)合,。

5. circ-CTNNB1與DDX3相互結(jié)合是否可以調(diào)控β-catenin的表達(dá)和活性,？過(guò)表達(dá)circ-CTNNB1促進(jìn)β-catenin蛋白表達(dá)的效應(yīng)，會(huì)被DDX3敲低或者DDX3抑制劑RK-33部分抵消,。同樣地,，過(guò)表達(dá)或者敲低circ-CTNNB1表達(dá)促進(jìn)或者抑制β-catenin活性的效應(yīng)，也會(huì)被RK-33處理或者DDX3過(guò)表達(dá)所部分抵消,。構(gòu)建不同截短體的DDX3進(jìn)行體外結(jié)合試驗(yàn),，證明了DDX3蛋白的256-315氨基酸（主要是Ia區(qū)域的274-279aa）對(duì)于circ-CTNNB1的結(jié)合是至關(guān)重要的。有趣的是,，circ-CTNNB1與DDX3兩者的表達(dá)并不會(huì)相互影響,。

6. 下一步作者繼續(xù)深入探究circ-CTNNB1的下游靶基因，通過(guò)circ-CTNNB1過(guò)表達(dá)后RNA-seq分析相關(guān)基因的變化,，發(fā)現(xiàn)1244種基因出現(xiàn)上調(diào)，986種基因出現(xiàn)下調(diào),；GO分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因大部分與Wnt信號(hào)通路相關(guān),，包括WNT1, WNT3，AXIN2, FZD10和BMP4這五種基因,。通過(guò)圖6B的方法篩選出共同調(diào)控這些與Wnt信號(hào)通路基因的轉(zhuǎn)錄因子,，主要是ERG、SP1和YY1,。作者發(fā)現(xiàn)只有敲低YY1的表達(dá)才可以抑制circ-CTNNB1誘導(dǎo)上調(diào)的β-catenin表達(dá),。Co-IP和BiFC實(shí)驗(yàn)均證明了DDX3與YY1相互結(jié)合，而且circ-CTNNB1過(guò)表達(dá)促進(jìn),，而RK-33處理抑制兩者的相互結(jié)合,。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明了circ-CTNNB1和DDX3表達(dá)對(duì)于促進(jìn)YY1轉(zhuǎn)錄活性的重要性，也證明了circ-CTNNB1、DDX3和YY1表達(dá)對(duì)于促進(jìn)Wnt信號(hào)通路相關(guān)的WNT1,、WNT2,、AXIN2, FZD10和BMP4基因的表達(dá)的重要性。

7. 靶向circ-CTNNB1-DDX3結(jié)合對(duì)腫瘤治療效應(yīng)的影響,？circ-CTNNB1表達(dá)敲低的細(xì)胞在小鼠體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移的能力會(huì)明顯降低,，小鼠存活率也都得到明顯提高，說(shuō)明靶向,。circ-CTNNB1可以獲得很好的抗腫瘤效應(yīng),。接著作者針對(duì)circ-CTNNB1-DDX3結(jié)合的重要區(qū)域研發(fā)了一種細(xì)胞通透性的靶向DDX3的長(zhǎng)度約為13aa的抑制性肽（DIP-13），通過(guò)IP和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明其可以體外明顯抑制circ-CTNNB1-DDX3相互結(jié)合,，同時(shí)體外應(yīng)用抑制腫瘤的生長(zhǎng),、增殖和侵襲能力（C,D）。通過(guò)分析成瘤體積,、腫瘤腫瘤,、Ki67增殖指數(shù)、CD31陽(yáng)性的微血管形成和下游基因表達(dá)情況等指標(biāo),，動(dòng)物體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用該DIP-13抑制肽可以明顯抑制小鼠的體內(nèi)成瘤能力,、抑制腫瘤的肺轉(zhuǎn)移情況和提高小鼠存活率。

參考文獻(xiàn)

1. Yang F,，et al. Cis-acting circ-CTNNB1 promotes β-catenin signaling and cancer progression via DDX3-mediated transactivation of YY1. Cancer Res. 2018 Dec 18. pii: canres.1559.2018. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-18-1559.