癌癥是威脅人類健康的重要疾病,，癌癥早篩對(duì)于癌癥的預(yù)防和治療意義重大。今天小編為大家解讀一篇癌癥早篩和區(qū)分癌種的基因測(cè)序新方法,，該文刊登在《Nature》,，原文題目為Sensitive tumour detection and classification using plasma cell-free DNA methylomes。

目前,，腫瘤診斷和治療的金標(biāo)準(zhǔn)是腫瘤組織活檢,，但隨著對(duì)腫瘤研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn),，這一金標(biāo)準(zhǔn)并不完美,，存在一定的局限性，如：因腫瘤的動(dòng)態(tài)變化,，首次診斷的組織活檢可能無(wú)法反映當(dāng)前腫瘤狀況（具有一定的滯后性）,；局部取樣可能無(wú)法反映全身癌變情況；組織活檢具有侵入性,，會(huì)出現(xiàn)多種潛在并發(fā)癥,，重復(fù)取樣受限等。

一,、液體活檢能夠彌補(bǔ)組織活檢的不足

隨著科技的進(jìn)步,，非侵入性、且可在不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)取樣的液體活檢技術(shù)得到迅速的發(fā)展,，因其正好能夠彌補(bǔ)組織活檢的不足,，使得其在癌癥檢測(cè)方面應(yīng)用的研究日益增多，因而備受關(guān)注,。（注：因液體活檢不能提供病理學(xué)診斷及蛋白表達(dá)檢測(cè)的重要信息,，目前尚不能取代組織活檢）

二、常規(guī)液體活檢在早期癌癥檢測(cè)中的瓶頸

液體活檢的主要研究對(duì)象是血漿游離DNA(cfDNA),。cfDNA是血液中細(xì)胞成分之外的小片段DNA,，是細(xì)胞凋亡或壞死后釋放入血的，在健康人血液中含量極微,，而在癌癥患者血液中顯著升高,。循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）則是由腫瘤細(xì)胞釋放到血液中的DNA，屬于cfDNA的一部分,。

cfDNA vs ctDNA

ctDNA的分析具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值,。目前，大多數(shù)液體活檢采用基于血漿cfDNA的體細(xì)胞突變檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)ctDNA,，然而,，由于早期癌癥患者高頻突變數(shù)量有限，致使檢測(cè)的靈敏度低,。

三,、DNA甲基化檢測(cè)

早期癌癥的篩查及治療后微小殘留病灶的檢測(cè)往往需要檢測(cè)靈敏度超出當(dāng)前檢測(cè)技術(shù)限制的檢測(cè)方法。相較于體細(xì)胞突變檢測(cè),，針對(duì)不同癌種組織的大規(guī)模表觀遺傳變化（DNA甲基化是目前研究的比較充分的表觀遺傳修飾形式）檢測(cè)方法的靈敏度不依賴于患者高頻突變數(shù)量,，對(duì)于早期癌癥的檢測(cè)具有更大的潛力,。

四、甲基化游離DNA免疫共沉淀測(cè)序

由于血漿cfDNA的豐度低且碎片化程度高,，限制了大部分血漿甲基化特異性PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用,，相關(guān)檢測(cè)研究也存在較大的挑戰(zhàn)。雖然有科學(xué)家嘗試?yán)萌蚪M甲基化測(cè)序（WGBS）進(jìn)行甲基化的檢測(cè),，但是,，由于在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過(guò)程中DNA降解率高達(dá)84%-96%，且檢測(cè)成本高,、信息覆蓋不全面,，導(dǎo)致檢測(cè)到的癌癥易感基因（CPGs）豐度低。

為了突破現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的限制,，來(lái)自加拿大多倫多瑪格麗特公主癌癥中心的Shu Yi Shen等研究者開(kāi)發(fā)了一種靈敏的,、可分離、檢測(cè)和分析低水平甲基化DNA的甲基化游離DNA免疫共沉淀測(cè)序（cfMeDIP-seq）方法,。該方法將免疫共沉淀技術(shù)與高通量測(cè)序結(jié)合,，通過(guò)對(duì)cfDNA中的甲基化DNA片段（富含CpG區(qū)域）進(jìn)行特異性富集，提高檢測(cè)效率,。同時(shí)結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)構(gòu)建一種分類器,，能夠識(shí)別血液樣本中癌癥來(lái)源的DNA，并確定癌種,。

cfMeDIP-seq技術(shù)簡(jiǎn)圖

五,、甲基化游離DNA免疫共沉淀測(cè)序的五大優(yōu)勢(shì)

（一）上樣量可低至1~10ng

因多數(shù)血漿樣本cfDNA含量遠(yuǎn)低于100ng，研究者優(yōu)化了現(xiàn)有的低上樣量甲基化DNA免疫共沉淀測(cè)序（MeDIP-seq,，≥100ng）,，使得cfMeDIP-seq的上樣量可低至1~10ng，通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)：該檢測(cè)方法可重現(xiàn)MeDIP-seq（100ng）,、簡(jiǎn)化甲基化測(cè)序（RRBS,，1000ng）和全基因組甲基化測(cè)序（WGBS，2000ng）的檢測(cè)結(jié)果,。提示該檢測(cè)方法的靈敏度高,，準(zhǔn)確性與其他檢測(cè)方法相當(dāng)。

（二）CpG富集倍數(shù)可達(dá)到上樣前的2倍

研究者發(fā)現(xiàn)：與MeDIP-seq相比,，cfMeDIP-seq在結(jié)直腸癌cfDNA甲基化檢測(cè)中表現(xiàn)出更強(qiáng)大的檢測(cè)重復(fù)相關(guān)性,。由于結(jié)合了免疫共沉淀技術(shù)，其CpG富集倍數(shù)可達(dá)到上樣前的2倍,。同時(shí),，研究人員還將cfMeDIP-seq與超深度雜交捕獲突變測(cè)序進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)cfMeDIP-seq在ctDNA檢測(cè)中有著較高的靈敏度,。

（三）檢測(cè)甲基化cfDNA追蹤早期癌癥ctDNA水平

研究者選取24名早期胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）患者作為病例組,，24名年齡,、性別相當(dāng)?shù)慕】等俗鳛閷?duì)照組，分別運(yùn)用cfMeDIP-seq技術(shù)進(jìn)行血漿cfDNA的檢測(cè),，共識(shí)別出14716個(gè)不同的甲基化修飾區(qū)域（其中病例組9931個(gè),，對(duì)照組4785個(gè)）,。通過(guò)檢測(cè)兩組參與者的組織樣本,，獲得了45173個(gè)差異甲基化CpGs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：血漿cfDNA信號(hào)與來(lái)源于腫瘤組織的ctDNA中的DNA甲基化相關(guān),，提示該方法能夠通過(guò)檢測(cè)甲基化cfDNA追蹤早期癌癥的ctDNA水平,。

（四）檢測(cè)癌癥的靈敏度高

研究者通過(guò)生物信息學(xué)模擬，檢測(cè)了不同數(shù)量的差異甲基化區(qū)域（DMRs）,、覆蓋率和ctDNA豐度的檢測(cè)概率,。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著差異甲基化區(qū)域（DMR）的增加，即使在較低測(cè)序深度和ctDNA豐度下,，檢測(cè)靈敏度也隨之增加,。提示：該方法的檢測(cè)靈敏度高。

（五）篩查早期癌癥的同時(shí)高準(zhǔn)確率的區(qū)分癌種

研究者對(duì)來(lái)自7個(gè)癌種[胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）,、結(jié)直腸癌（CRC）,、乳腺癌（BRCA）、肺癌（LUC）,、腎癌（RCC）,、膀胱癌（BLCA）、急性髓細(xì)胞性白血?。ˋML）]的病例組及健康對(duì)照組的189份血漿樣品進(jìn)行cfMeDIP-seq檢測(cè),。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該檢測(cè)方法可以通過(guò)識(shí)別特定的ctDNA甲基化譜區(qū)分癌種。緊接著,，研究者進(jìn)行了機(jī)器學(xué)習(xí)分析,，基于大數(shù)據(jù)創(chuàng)建能夠“識(shí)別血液樣本中腫瘤DNA存在”以及“確定癌種”的cfDNA甲基化分類器，結(jié)果顯示：該分類器主要由腫瘤特異性DNA甲基化模式驅(qū)動(dòng),，而不是由腫瘤微環(huán)境中的血細(xì)胞或細(xì)胞組成的波動(dòng)驅(qū)動(dòng),，能夠在早篩的同時(shí)高準(zhǔn)確率的區(qū)分癌種。

總結(jié)：

該研究將高通量測(cè)序技術(shù),、免疫共沉淀技術(shù)及基于大數(shù)據(jù)的機(jī)器學(xué)習(xí)方法相結(jié)合開(kāi)發(fā)了cfMeDIP-seq檢測(cè)方法,，通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)證明：cfDNA甲基化特征檢測(cè)作為非侵入性手段，在早期癌癥檢測(cè)的靈敏度,、準(zhǔn)確性,、成本效益以及區(qū)分癌種等方面都有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ瑸槲磥?lái)癌癥早篩及癌種診斷的非侵入性檢測(cè)帶來(lái)希望,，但該方法還需要在獨(dú)立樣本中進(jìn)行驗(yàn)證,。

另外,，需注意原文沒(méi)有提及的一些細(xì)節(jié)問(wèn)題：如：由于cfDNA半衰期短，在研究過(guò)程中需要特別注意采樣試管的選擇,、樣本儲(chǔ)存的環(huán)境以及樣本處理方法是否嚴(yán)格的按照標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行,，以確保檢測(cè)樣品的質(zhì)量合格，從而保障檢測(cè)的準(zhǔn)確性,；在臨床研究中一定要把好大數(shù)據(jù)關(guān),，即大數(shù)據(jù)的數(shù)量和質(zhì)量，以提高機(jī)器學(xué)習(xí)的準(zhǔn)確性,，進(jìn)而保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確,。相信隨著人類對(duì)癌癥認(rèn)識(shí)的加深、科技的發(fā)展,、檢測(cè)技術(shù)的革新,，未來(lái)癌癥早篩及癌種診斷的非侵入性檢測(cè)或可成為現(xiàn)實(shí)。