液體活檢目前主要用于癌癥不同階段的篩查和治療,。

即使在無癥狀人群中,，它也可以有效識(shí)別出癌癥早期患者，這一特點(diǎn)使之成為標(biāo)準(zhǔn)腫瘤檢測中重要的非侵入性輔助方法,。

Cell-free DNA

液體活檢中應(yīng)用最廣泛的分析指標(biāo)是外周血游離DNA（cfDNA）,。此外，還包括其他體液系統(tǒng)中腫瘤釋放的cfNA（cfDNA、cfRNA等）,。

cfDNA 就是游離于細(xì)胞外的 DNA,，它即包含 ctDNA （circulating tumor DNA）也包括來自于正常細(xì)胞的 DNA 碎片。例如,，腦脊液,、唾液、尿液,、胸腔和腹腔積液,、糞便等，都是cfDNA的潛在來源,，上述樣本經(jīng)cfDNA富集可用于不同類型癌癥的檢測,。在健康個(gè)體中，cfDNA來源于正常的細(xì)胞更新,，而在癌癥患者中cfDNA含量會(huì)升高,，cfDNA長度約為167bp，半衰期不足1小時(shí),。

DNA甲基化

表觀遺傳學(xué)信息如甲基化或蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物結(jié)合ctDNA已被證明有助于早期確定腫瘤的起源,。研究人員發(fā)現(xiàn)，來自甲基化組數(shù)據(jù)的腫瘤和組織特異性模式有助于疾病分類,。腫瘤DNA甲基化譜與血漿ctDNA甲基化譜高度相關(guān),，可用于乳腺癌、結(jié)腸癌,、肝癌和肺癌等疾病的診斷和預(yù)后判斷,。然而，與DNA變異檢測類似,，cfDNA中DNA甲基化變化程度變化和低起始量,，對(duì)檢出技術(shù)的覆蓋率、成本和靈敏度提出了巨大挑戰(zhàn),。

Cell-free DNA甲基化的臨床應(yīng)用

? 癌癥篩查與早診

在無癥狀人群中,，液體活檢可以用于癌癥患者的識(shí)別，以提高早期診斷和更好的干預(yù),。研究表明,，腫瘤DNA（ctDNA）可用于早期肺癌診斷(I期或II期)，具有較高的敏感性和特異性,。除了DNA突變,，DNA甲基化和cfDNA水平的量化可以結(jié)合起來提供穩(wěn)健和一致的結(jié)果。SEPT9基因甲基化檢測是通過美國食品與藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的第一個(gè)結(jié)腸直腸癌(CRC)血液篩查試驗(yàn),，與蛋白質(zhì)標(biāo)記物相比,，具有較高的敏感性和特異性,。

? 微小病灶殘留和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

微小病灶殘留(MRD)是手術(shù)或治療后腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因。不幸的是,，目前還沒有有效的方法來鑒別MRD和復(fù)發(fā),。此外，用于復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分層的常規(guī)臨床或病理參數(shù)不足以準(zhǔn)確指導(dǎo)輔助治療,，導(dǎo)致患者在大部分患者已治愈且不需要此類潛在有害治療的情況下,，仍不得不接受不加區(qū)分的治療。經(jīng)證實(shí),，ctDNA甲基化標(biāo)記物可以提示MRD的存在,，即使在沒有任何其他臨床疾病證據(jù)的情況下，也可以識(shí)別復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高的患者,。將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組將使可能受益最大的患者能夠接受輔助治療,，同時(shí)使低風(fēng)險(xiǎn)患者免于不必要的合并癥和不良事件的風(fēng)險(xiǎn)。

最近,，一項(xiàng)前瞻性臨床試驗(yàn)評(píng)估了II和III期CRC患者術(shù)后ctDNA 標(biāo)志物(WIF1和NPY)與腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系,。采集805例II-III期CRC患者術(shù)前和術(shù)后的血漿樣本(NCT00958737)。在手術(shù)切除后第一次隨訪時(shí),，采用ddPCR檢測WIF1和NPY在ctDNA甲基化情況,。作者觀察到，ctDNA陰性組2年無病生存率顯著高于ctDNA陽性組(82% vs 64%),，這表明ctDNA甲基化分析可以用于預(yù)測微小病灶殘留的病變,。

? 治療選擇和預(yù)后

cfDNA的半衰期較短，可以與腫瘤細(xì)胞狀態(tài)直接相關(guān),，從而為治療期間持續(xù)動(dòng)態(tài)觀察監(jiān)測癌癥負(fù)擔(dān)提供了可能性,。有研究表明ctDNA動(dòng)力學(xué)與治療反應(yīng)相關(guān)。例如,，血清的MGMT的甲基化水平與原發(fā)組織高度,，在cfDNA中檢測MGMT的甲基化水平能夠預(yù)測膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者在細(xì)胞毒性治療后的響應(yīng)時(shí)間和進(jìn)展。一項(xiàng)前瞻性研究驗(yàn)證了乳腺癌甲基化特異性PCR cfDNA檢測方法,，該方法針對(duì)6個(gè)癌癥相關(guān)啟動(dòng)子的CGI來監(jiān)測治療反應(yīng),。這6個(gè)位點(diǎn)的累積甲基化得分與轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的生存結(jié)果顯著相關(guān)。

? ctDNA的組織溯源追蹤

目前除了使用ctDNA作為液體活檢來檢測癌癥的巨大興趣之外,，它也可以用于ctDNA的起源和腫瘤的定位,。事實(shí)上，在每一種腫瘤組織和每一種組織中都有獨(dú)特的DNA甲基化譜,。因此，甲基化譜的差異可以識(shí)別ctDNA來源的組織,。

據(jù)報(bào)道,，一項(xiàng)研究開發(fā)了組織特異性DNA甲基化生物標(biāo)志物,，利用基于數(shù)字PCR的方法測量肝臟和結(jié)腸源DNA的血漿濃度，并探索其在轉(zhuǎn)移性CRC研究中的臨床應(yīng)用,。結(jié)果證實(shí)了肝臟特異性標(biāo)記物在反映血漿中肝臟源性DNA濃度方面的準(zhǔn)確性(檢測HCC的特異性為93%,，敏感性為60%)。 肝源性DNA的絕對(duì)濃度有助于有無肝轉(zhuǎn)移的CRC患者提供了更好的區(qū)分,。這些結(jié)果表明,，ctDNA甲基化有助于腫瘤發(fā)生的組織溯源。  

Cell-free DNA甲基化的研究方法

下表列出了市面上常見的DNA甲基化的檢測方法

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[2] Van Der Pol Y, Mouliere F. Toward the Early Detection of Cancer by Decoding the Epigenetic and Environmental Fingerprints of Cell-Free DNA [J]. Cancer Cell, 2019, 36(4): 350-68.