腫瘤轉(zhuǎn)移是指癌細(xì)胞從原發(fā)部位分散,，到達(dá)其他部位繼續(xù)生長(zhǎng)的過程,。在超過90%的病例中腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散是癌癥患者死亡的主要原因。雖然轉(zhuǎn)移瘤與原發(fā)瘤有共同的驅(qū)動(dòng)突變,，但是在轉(zhuǎn)移和治療期間，轉(zhuǎn)移癌往往演化出了新的突變,。因此,，在治療過程中對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤進(jìn)行新鮮活檢是重要的。

樣本選擇：

        來自Michigan Oncology Sequencing (MI-ONCOSEQ) Program 的500例成年轉(zhuǎn)移瘤患者,，涉及30多種癌癥,，從22個(gè)不同器官轉(zhuǎn)移的獲取樣本（簡(jiǎn)稱為MET500隊(duì)列）。

樣本測(cè)序：

        對(duì)每個(gè)患者進(jìn)行腫瘤-種系DNA配對(duì)外顯子測(cè)序,、RNAseq

轉(zhuǎn)移癌的分子變異

本研究對(duì)500名轉(zhuǎn)移癌患者進(jìn)行了測(cè)序,，男性258人（51.6%），女性242人(48.4%),，其中的460個(gè)為白人 (92%),，其余40人為其它種族 (8%),。

圖1 a中展示的是MET500隊(duì)列中的癌癥類型，數(shù)量最多的是轉(zhuǎn)移性前列腺癌（93例,，18.6%）,，其次為轉(zhuǎn)移性乳腺癌（91例，18.2）和軟組織肉瘤（42例,，8.4%）,。圖1b展示的是不同轉(zhuǎn)移點(diǎn)，最常見的為：肝（134例）,，淋巴結(jié)（114例）,，肺（46例），骨（42例）,。

通過配對(duì)外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn),，在目標(biāo)區(qū)域平均每位患者攜帶119個(gè)體細(xì)胞突變，顯著大于TCGA中的原發(fā)性腫瘤（圖1 c）,。進(jìn)行SNV,、CNV和基因融合的綜合分析，發(fā)現(xiàn)抑癌基因中最常見突變的是：TP53（266,53.2％）,，CDKN2A（80,16％）,，PTEN（79,15.8％）和RB1（68,13.6％）；而致癌基因最常見的突變則有：PIK3CA（67,13.4％）,，AR（63,12.6％）和KRAS（ 51％,，10.2％）（圖1d/e）。

圖1 轉(zhuǎn)移癌分子突變景觀

轉(zhuǎn)移癌的種系變異

通過種系DNA的測(cè)序,，共鑒定出63個(gè)推定的致病種系突變（PPGMs, presumed pathogenic germline mutations）,，涉及61例患者的18個(gè)基因（圖2a）。其中包括30個(gè)有害的錯(cuò)義突變,、8個(gè)無義突變,、20個(gè)移碼突變、5個(gè)有害的剪接位點(diǎn)突變,。75%的PPGM與DNA修復(fù)相關(guān),，最常見的有：MUTYH (n= 10, 16%), BRCA2 (n= 9,14%), CHEK2 (n= 9, 14%), BRCA1 (n= 5, 8%)。61例PPGM攜帶者中,，30例（49%）在腫瘤基因組中具有體細(xì)胞第二等位基因異常（somatic second allele aberration）,，包括雜合性喪失，并表現(xiàn)出與致病基因一致的分子表型,。

將MET500隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)的PPGM基因的頻率與Exome Aggregation Consortium收集的52,790個(gè)人群的頻率進(jìn)行比較,，發(fā)現(xiàn)任何PPGM基因在轉(zhuǎn)移癌中出現(xiàn)的概率都超過了總體樣本體(oddsratio= 3.00, range 2.28–3.9, P= 1× 10?13)。分析發(fā)現(xiàn)在MET500中富集的基因包括BRCA1,、BRCA2,、APC,、CHEK2、MITF,、MLH1,、NBN、RB1,。

圖2    轉(zhuǎn)移癌中推定的致病種系變異

轉(zhuǎn)移癌的基因融合

為了鑒定導(dǎo)致激活和失活的基因融合,，研究者分析了來自496個(gè)轉(zhuǎn)移癌RNA的868個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫。這些融合涉及12,027個(gè)不同的基因?qū)?，平均每個(gè)腫瘤存在34個(gè)融合,。有199例（39.8%）至少攜帶一個(gè)可能致病的融合，其中138例攜帶激活融合,，103例攜帶有害融合,。激活融合可以分為：DNA結(jié)合（n=88）, 蛋白激酶（n = 29）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（n=21）(圖3b)。功能喪失融合則分為：腫瘤抑制基因（n = 59）,，染色質(zhì)修飾基因（n = 35）,，細(xì)胞粘附相關(guān)基因（n = 9）。其中最常見的融合腫瘤抑制基因是NF1（n = 18）,，TP53（n = 11）,，PTEN（n ?11）和RB1（n = 6）。此外,，研究者還鑒定出8對(duì)新的融合基因（圖3c）,，他們認(rèn)為轉(zhuǎn)移癌中的這些融合是致病的。

圖3    轉(zhuǎn)移癌中的基因融合

轉(zhuǎn)移癌的轉(zhuǎn)錄特征

為了研究轉(zhuǎn)移癌表達(dá)譜潛在的臨床應(yīng)用,，研究者分析了496例活檢樣本（868個(gè)文庫）的轉(zhuǎn)錄組,。首先評(píng)估在不同轉(zhuǎn)移病灶之間，組織/癌癥類型特異性基因表達(dá)在多大程度上保持不變,。使用t-分布鄰域嵌入算法（t-SNE）,，將MET500的原發(fā)腫瘤標(biāo)記的表達(dá)數(shù)據(jù)降維可視化。與原發(fā)腫瘤相比,，轉(zhuǎn)移癌樣品的分離更少（less well separated）,、并具有更多異質(zhì)性，并且沒有在活檢部分的基礎(chǔ)上隔離（segregate）,，但肝組織活檢樣本除外（圖4a 和圖5c,d）。從36個(gè)正常組織中得到組織特異性標(biāo)記基因,，并比較其表達(dá)水平,，發(fā)現(xiàn)正常組織、原發(fā)腫瘤,、轉(zhuǎn)移樣本三者之間存在差異,，觀察到顯著的與疾病進(jìn)展有關(guān)的去分化（圖5 e）,。

接下來觀察與癌相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄特征。與正常組織相比,，大多數(shù)致癌特征的轉(zhuǎn)錄輸出都有所增加,，表明一種癌癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序的全局轉(zhuǎn)換（global shift）。對(duì)患者特異性特征活性的推斷揭示了curated pathways的協(xié)同變化,，將這些通路合并成少數(shù)幾個(gè)主要的癌癥特征：干擾素反應(yīng),、炎癥反應(yīng)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）,、增殖,、新陳代謝。與正常組織相比,，轉(zhuǎn)移性腫瘤顯示出增殖,、應(yīng)激反應(yīng)和新陳代謝的全局提升，而EMT和癌癥免疫反應(yīng)標(biāo)記則上調(diào)或下調(diào),。

進(jìn)一步描述特征并進(jìn)行聚類分析,，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)典型的癌癥標(biāo)記：免疫反應(yīng)、EMT,、增殖和代謝（圖4 b）,。轉(zhuǎn)移性腫瘤主要分為與炎癥特征相關(guān)的EMT亞型，與新陳代謝和應(yīng)激反應(yīng)升高相關(guān)的增殖亞型,。同時(shí),，我們還觀察到增殖標(biāo)記和EMT標(biāo)記的負(fù)相關(guān)性（圖4c）。

圖4    轉(zhuǎn)移癌的不同轉(zhuǎn)錄模式

圖5     轉(zhuǎn)移性泛癌轉(zhuǎn)錄組分析

轉(zhuǎn)移性疾病的免疫微環(huán)境

為了表征宿主免疫反應(yīng)的表型,，研究者使用了外顯子組,、RNA-seq和一種專門的T細(xì)胞譜系分析。研究者開發(fā)了一個(gè)基于RNA-seq的分?jǐn)?shù)——MImmScore,，用于評(píng)估白細(xì)胞浸潤的程度,。研究發(fā)現(xiàn)MImmScore與腫瘤含量呈負(fù)相關(guān)，與間質(zhì)浸潤程度呈正相關(guān),。研究者還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性腫瘤的免疫浸潤與腫瘤原發(fā)類型關(guān)系密切（圖6a）,，而與活檢部位的關(guān)聯(lián)不大。免疫浸潤除了與癌癥類型相關(guān)之外,，也與個(gè)體差異相關(guān),。令人矚目的是，即使在對(duì)免疫治療無應(yīng)答的腫瘤類型的患者中,，也發(fā)現(xiàn)了具有高水平免疫浸潤的個(gè)別患者,。

假設(shè)轉(zhuǎn)移腫瘤不僅是大小不同，而且在白細(xì)胞類型、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）和巨噬細(xì)胞的組合上也有不同,。無監(jiān)督聚類顯示了在大量腫瘤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,，TIL組成有顯著差異的樣本組（圖6b）。這些癌癥可以通過M2與M0(未極化)的巨噬細(xì)胞的不同比例(clusters TIL-2, -4, -6, -7),，及CD8+ 與 CD4+ T細(xì)胞的不同比例(high CD8+ TIL-1, high CD4+ TIL-4)強(qiáng)烈區(qū)分,。研究還發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞數(shù)量的增加與T細(xì)胞克隆的顯著擴(kuò)增（increased clonality）（圖6c）及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,、細(xì)胞毒性T細(xì)胞的伴隨性比例減少相關(guān),。

接下來關(guān)注T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞（APC）表面上配體/受體對(duì)的表達(dá)。這些分子要么是共刺激,，要么是t細(xì)胞激活所必需的,，或者是在免疫檢查點(diǎn)起共抑制作用（圖6e）。 在獨(dú)立的聚類分析中,，大多數(shù)免疫沉默（Tcell-0,，APC-0）或免疫活躍（Tcell-1，APC-1）的患者,，都具有非常顯著的重疊,。 重要的是，APC-1中幾乎所有的樣品都表達(dá)CD80 / CD86,，而Tcell-1中的幾乎所有樣品都表達(dá)CD28,。 CD80 / CD86是CD28受體的配體，是T細(xì)胞活化的關(guān)鍵信號(hào),。

最后關(guān)注免疫治療新的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物與轉(zhuǎn)錄組免疫表型之間的關(guān)系,。將患者分為三類：免疫沉默、部分活躍,、完全活躍,。若樣品具有全部或部分TIL-5、APC-1,、Tcell-1活化,，則分別被歸類為完全活躍或部分活躍?；钴S類別中的患者表現(xiàn)出PD-L1（圖6f）,、HLA和顆粒酶的的表達(dá)增加，并且具有較高的突變負(fù)荷（圖6g）,。 最后,，利用轉(zhuǎn)移性黑色素瘤免疫治療的預(yù)測(cè)特征，研究者開發(fā)了一個(gè)臨床反應(yīng)評(píng)分,，如同所預(yù)期的,，免疫活躍的患者具有顯著更高的臨床反應(yīng)評(píng)分（圖6h）,。

    圖6 轉(zhuǎn)移癌的免疫微環(huán)境

本研究中呈現(xiàn)的轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤的研究是對(duì)原發(fā)性癌癥研究的有力補(bǔ)充,。轉(zhuǎn)移性癌癥是在遺傳,、轉(zhuǎn)錄組和微環(huán)境水平都具有高度異質(zhì)性的疾病。因此,，治療晚期癌癥的進(jìn)展將取決于我們從轉(zhuǎn)移癌異質(zhì)性中得到的治療啟示,，并開發(fā)出與患者匹配的、最有希望的篩選和治療方案,。