德國科學(xué)家Ugur Sahin及其團隊首次將一種以RNA為基礎(chǔ)的個性化疫苗治療方案應(yīng)用于人體,， 該療法對每位病人基因組上檢測到的突變進行新抗原預(yù)測，然后設(shè)計個性化疫苗,。通常，自然條件下的免疫系統(tǒng)識別癌細胞的效率極低,，而他們所提出的這種疫苗能夠激發(fā)免疫系統(tǒng),，以一種靶向性的方式來對抗腫瘤。

免疫治療（immunotherapy）是指機體對抗原的識別能力低下,，通過人為的增強或抑制機體的免疫功能來達到治療疾病的目的,。自然條件下人體免疫系統(tǒng)識別腫瘤細胞的效率極低，因此德國科學(xué)家Ugur Sahin及其團隊介紹了個性化腫瘤疫苗的概念,，采用了一種基于RNA的多重表位方法,，激活免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤。研究人員利用了10個突變位點的遺傳信息來實現(xiàn)合成過程,，使得能夠在幾個地方同時攻擊腫瘤,，確保了腫瘤無力進行抵抗。此次研究首次應(yīng)用在人體黑色素瘤中,。

樣品選擇：符合具有完全緩解,、部分緩解或疾病穩(wěn)定的惡性黑色素瘤III期或IV期的13位成年人。

實驗及分析方法：

1. 高通量測序

1. 構(gòu)建DNA和RNA文庫,。

2. 制備MZ-γ氨基丁酸-018和匹配的PBMC的全基因組測序的NGS文庫,。

3. 使用Illumina TruSeq PE集群套件的v3-cBot-HS對DNA和RNA末端進行測序。

2. 生物信息學(xué)和突變檢測

1. 使用Python編程語言實現(xiàn)突變相關(guān)數(shù)據(jù)的分析,。

   DNA文庫>150 x 106reads,，RNA文庫>75 x 106reads

2.  采用bwa將DNA讀數(shù)與參考基因組hg19進行比對。

3. 新表位優(yōu)先排序及選擇

1. 采用基于預(yù)測的HLA I類結(jié)合進行排序。

2. 基于MHC I和MHC II結(jié)合預(yù)測來評估靶肽的靶標選擇板,。

4. Sanger測序

1. 采用Sanger測序技術(shù)對引物進行設(shè)計,。

5. 體外轉(zhuǎn)錄RNA的制備

1. 進行體外轉(zhuǎn)錄RNA的制備，并通過凝膠電泳和微流體毛細管電泳（Experion,，Biorad）評估RNA的完整性,。

6. 體外刺激PBMCs

1. 對外周血單個核細胞（PBMCs）刺激11天后，通過流式細胞術(shù)分析細胞,。

7. 酶聯(lián)免疫斑點（ELISpot）

1. 對細胞進行ELISpot測定之后,，通過ImmunoCapture V6.3軟件進行分析。

   將由突變的RNA或肽刺激的T細胞應(yīng)答與對照RNA（螢光素酶）電穿孔的靶細胞或未加載的靶細胞進行比較,。

8. 多聚體染色和數(shù)據(jù)分析

1. 用多聚體對細胞表面標記物和活-死細胞染色,。

   BD LSR Fortessa SORP上獲得染色后的細胞

9. 細胞內(nèi)細胞因子染色

1. 對細胞內(nèi)細胞因子（IL-2 MQ1-17H12，IFNγB27,，所有BD和TNFαMab11 Biolegend）進行染色,。

   在BD FACS Canto II（Becton Dickinson）上獲得樣品

10. 單細胞分選

1.   采用BD FACS Aria流式細胞儀（BD Biosciences）進行新抗原特異性T細胞的分選

11. 新表位特異性TCR的克隆

1. 進行來自單個T細胞的T細胞受體（TCR）基因的克隆。

2. 采用來自PBMC的總RNA進行TCR-α/β深度測序,。

3. 在DNA文庫中使用Typer Toolbox軟件分析測序數(shù)據(jù),。

   每個樣品的總TCR讀數(shù)：1.1×106?1.5×106reads

12. 定量RT-PCR

1. 采用實時PCR系統(tǒng)進行qRT-PCR.

2. 采用定量SYBR Green Real-Time PCR或TaqMan基因表達測定方法制備和分析樣品

13. 免疫組織化學(xué)

1. 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)進行抗原抗體反應(yīng)

2. 對經(jīng)過計算機斷層掃描和手動預(yù)定義后的腫瘤采用計算機圖像分析軟件量化正常組織和壞死區(qū)域。

14. 患者P04中B2M損失的表征

1. 通過手動整理MZ-γ氨基丁酸-018與整合基因組學(xué)中的外顯子比對結(jié)果來檢測B2M基因座的缺失,，并定義B2M上游的刪除起始點,。

15. 克隆HLA抗原

1. 將HLA抗原克隆到適當(dāng)?shù)捏w外轉(zhuǎn)錄（IVT）載體中。

16. RNA轉(zhuǎn)移到細胞中

17. 肽

1. 使用重疊肽庫：具有11個氨基酸重疊并由15mer合成的肽,，其覆蓋27mer新抗原序列（每個新抗原4個OLPs）或控制抗原序列,。

18. 流式細胞術(shù)分析

1. 在BD FACSCanto II分析流式細胞儀（BD Biosciences）上進行流式細胞術(shù)分析。

2. 使用FlowJo軟件（Tree Star）的第十版對獲取的數(shù)據(jù)進行分析,。

19. 細胞毒性測定

1. 基于熒光素進行細胞毒性測定,。

2. 根據(jù)公式計算特異殺傷：

   

20. 細胞凋亡測定

1. 在37℃，5％CO2下,，使用IncuCyte Zoom Live-content成像系統(tǒng)將細胞放大十倍,。

2. 使用IncuCyte分析軟件分析數(shù)據(jù)，以檢測和定量每個圖像的凋亡（綠點）細胞,。

3. 使用GraphPad Prism軟件繪制平均綠點數(shù)（凋亡數(shù)）,。

a. 通過免疫接種廣泛動員突變特異性免疫

 圖1 通過免疫接種廣泛動員突變特異性免疫

①觀察到疫苗經(jīng)皮正常給入人體后，在自身樹突細胞的ELISpot測定讀數(shù)中檢測到60％預(yù)測的新表位的反應(yīng),，表明受試的13位患者中每位患者的T細胞能對抗至少三個突變位點,。

②觀察到預(yù)先存在的針對三分之一的免疫原性新表位有弱免疫應(yīng)答，但在接種疫苗后反應(yīng)明顯增強,，而其他三分之二為初次應(yīng)答,，表明疫苗對于腫瘤免疫應(yīng)答具有刺激作用,。

③觀察到免疫原性突變均勻分布在五聚體RNA的五個位置，大多數(shù)新表位在CD4 +應(yīng)答,，較小的部分被CD8 +細胞毒性淋巴細胞（CTLs）識別,，表明了免疫原性突變位點缺乏位置偏倚。

④觀察到大多數(shù)新表位疫苗誘導(dǎo)的反應(yīng)沒有或很少與用RNA編碼的野生型表位轉(zhuǎn)染的自體樹突狀細胞（DCs）交叉反應(yīng),。

b. 通過疫苗接種使具有中樞和效應(yīng)記憶表型的新表位特異性T細胞快速擴增

 圖2    通過疫苗接種使得具有中樞和效應(yīng)記憶表型的新表位特異性T細胞的快速擴增

①PBMCs的讀取不需要預(yù)先擴增ELISpot中新表位 - RNA加載的自體樹突狀細胞,，表明血液中五分之一的免疫原性突變反應(yīng)在體外無刺激作用，而在接種新表位和共有腫瘤相關(guān)自身抗原的患者中新表位應(yīng)答更強,，可能是由于缺乏中樞免疫耐受,。

②以活化誘導(dǎo)的γ干擾素-分泌為基礎(chǔ)的單細胞經(jīng)過分選得到CD8 + T細胞，經(jīng)過體外刺激與新表位 - RNA負載的自體樹突細胞經(jīng)過TCR克隆,，使用肽沖擊細胞測試編碼鑒定的TCR-α/β鏈的RNA與來自健康體的CD8 + T細胞,，然后進行共轉(zhuǎn)染。觀察得到的新抗原特異性TCR的頻率,。在來自患者的接種疫苗前血液樣品的TCR深度測序數(shù)據(jù)中未檢測到新抗原特異性TCR序列,，但在接種后的樣品中含量豐富，證實CTL是首次誘導(dǎo)產(chǎn)生的,。

③通過無RNA的樹突狀細胞與染色后的樹突狀細胞進行對照得出T細胞不僅具有弱的PD-1+,、效應(yīng)記憶表型并且還有完全功能的γ干擾素和TNFα伴隨表達對抗原的刺激。

 c.    通過疫苗接種在高復(fù)發(fā)風(fēng)險的黑素瘤患者中進行疾病控制

圖3 通過疫苗接種在高復(fù)發(fā)風(fēng)險的黑素瘤患者中進行疾病控制

①  統(tǒng)計受試患者復(fù)發(fā),、治療和無進展的數(shù)據(jù)以及之后每月對新表位RNA疫苗接種的轉(zhuǎn)移事件的累計總和,， 證明了受試患者有復(fù)發(fā)的高風(fēng)險。

② 通過比對沒有轉(zhuǎn)移事件的累積觀察時間和事件發(fā)生月數(shù)的Fisher精確檢驗,，和目標病變的計算機斷層掃描以及ELISpot對P07的疫苗誘導(dǎo)的體外反應(yīng)，表明新表位疫苗接種前后所有患者的黑色素瘤復(fù)發(fā)顯示縱向累積復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移事件（P <>

③ 觀察到P17患者的疫苗誘導(dǎo)T細胞反應(yīng),，表明疫苗激發(fā)了腫瘤免疫應(yīng)答,。

d.    新表位誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)與P04中B2M缺陷黑素瘤細胞的生長免疫逃逸相關(guān)。

圖4 新表位誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)與P04中B2M缺陷黑素瘤細胞的生長免疫逃逸相關(guān)

①  針對HLA多聚體檢測接種后病變的血液,，和TIL中的兩個新表位的CD8 + T細胞的頻率,，在不同條件下HLA刪除和倒置使得基因組映射而導(dǎo)致B2M丟失。通過熒光素酶細胞毒性測定來測量新表位的TCR,，最后轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)移黑素瘤細胞的B2M,。在12例應(yīng)用后，切除殘留的轉(zhuǎn)移灶,，病理診斷幾乎完全壞死,，與預(yù)接種黑素瘤標本相比：CD8 + T細胞浸潤、PD-L1染色,、免疫激活和炎癥標記物的表達均增加,。

由于黑色素瘤具有多基因突變的性質(zhì),，選用黑色素瘤作為實驗對象讓科學(xué)家有充足的機會選擇合適的抗原。在13位接種疫苗的患者中,，8人腫瘤完全消失且23個月內(nèi)無復(fù)發(fā),，其余5名患者由于接種疫苗時腫瘤已經(jīng)擴散，有2人出現(xiàn)腫瘤縮小,，其中1人接受輔助治療后腫瘤完全消退,，證明了基于突變組學(xué)的個性化RNA疫苗的臨床可行性、安全性和抗腫瘤活性,。免疫治療發(fā)揮了精準醫(yī)療的極致但是仍面臨挑戰(zhàn)——每個腫瘤都有獨特的“指紋”,，要研制出個性化的疫苗需要投入大量的時間與精力。

參考文獻：

[1] Carmen Loquai, ?zlem Türeci,et al.[J].Nature, 2017, 547: 222-226.