寒風(fēng)凜冽，又到了一年一度寫標書的季節(jié),，你開始準備了么,？在分子機制的研究中，蛋白和蛋白之間的互作研究可以說是非常經(jīng)典了,，研究蛋白互作的方法有很多,，今天我們來介紹九種。

CoIP其實就是兩個蛋白相互的IP（免疫沉淀反應(yīng)）實驗，在已知蛋白B和C之間有相互作用的前提下，這種前提一般需要有一個酵母雙雜實驗或者Pulldown實驗來作為支持,。IP就是用來驗證蛋白C和蛋白B之間相互作用的,。如果在Agarose珠上的Protean A/G所結(jié)合的抗體，可以結(jié)合并拉下蛋白B,，那用Western Blot即可檢測出蛋白C的表達,，反之亦然，通過這種相互間免疫共沉淀的實驗,，就可以明確地驗證出,，B與C之間的相互作用了。

比如這份標書：PYK2促進肝癌細胞遷移的一個新的分子機制研究：結(jié)合并磷酸化E-cadherin,？（百度檢索題目可查到全文）

這個實驗跟免疫共沉淀實驗很像，不同的是免疫共沉淀是在細胞里進行的,，在眾多的蛋白里,，拉住A蛋白的同時,把B蛋白也給拉出來了，這還不能證明是直接的結(jié)合,，很有可能是A 拉住了C,，而C拉住了B，這樣拉住A蛋白的同時也能把B蛋白也給拉出來,。要證明直接的結(jié)合就是Pull-down實驗,。提純所要研究的兩個蛋白（一般是在BL21等菌種表達提純），這兩個蛋白帶上不同的標簽（提純蛋白一般帶GST或者HIIS標簽）,，然后將他們放在同一個體系里,，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一個蛋白拉下來，用WB檢測另一個蛋白的存在,。

比如這份標書：惡性腫瘤的發(fā)生,、發(fā)展的細胞表觀遺傳學(xué)機制。（同樣可以百度檢索到全文）

將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法,。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出,，從而可對抗原進行細胞定位。兩種不同的蛋白使用不同屬性的不同顏色熒光標記后,，通過觀察顏色的變化確定是否有共定位,，也可以使用軟件進行分析。應(yīng)用策略：該技術(shù)的主要特點是：特異性強,、敏感性高,、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足,，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜,。

比如這份標書：惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的細胞表觀遺傳學(xué)機制,。（同上,，可以百度檢索到全文）

熒光能量共振轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,。當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊,，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移,，即FRET現(xiàn)象,，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強（敏化熒光）,。

青色熒光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）,、黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）為目前蛋白-蛋白相互作用研究中最廣泛應(yīng)用的FRET對。CFP的發(fā)射光譜與YFP的吸收光譜相重疊,。將供體蛋白CFG和受體蛋白YFG分別與兩種目的蛋白融合表達,。當(dāng)兩個融合蛋白之間的距離在5-10nm的范圍內(nèi)，則供體CFP發(fā)出的熒光可被YFP吸收,，并激發(fā)YFP發(fā)出黃色熒光,，此時通過測量CFP熒光強度的損失量來確定這兩個蛋白是否相互作用。兩個蛋白距離越近,，CFP所發(fā)出的熒光被YFP接收的量就越多,，檢測器所接收到的熒光就越少。

比如這份標書：重大心血管疾病相關(guān)GPCR新藥物靶點的基礎(chǔ)研究（百度可以找到這份標書）

Duolink采用PLA專業(yè)技術(shù),，通過一抗、二抗,、RCA滾環(huán)復(fù)制來放大熒光信號,。proximity ligation assay(鄰位連接技術(shù),PLA)：一種高靈敏度的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)。Duolink技術(shù)可以得到很高的分辨率和特異性,，可以更清晰的,、定量的研究蛋白-蛋白相互作用、蛋白的磷酸化水平,、蛋白的定量等,。這種方法可以檢測到較弱的結(jié)合，如果上面的幾種方法做不出來的話,，可以考慮這個方法,，不過試劑盒是比較貴的,。

目前還沒有檢索到標書里有寫到的，標書里提到的蛋白的相關(guān)作用的研究方法以前面四種為主,。

這是在活細胞中觀察蛋白相互作用的很好的方法。這個方法還是存在假陽性的,，細胞里大量表達的分段的YFP可能會不受研究蛋白的結(jié)合與否而自己結(jié)合在一起,，所以陰性對照的使用非常重要。并且YFP兩段結(jié)合在一起后,，基本是不可逆的,，小分子或其他抑制劑很難使結(jié)合的蛋白分開，在建模的時候要考慮到這個因素,。

此方法與BIFC的最大區(qū)別在于，BIFC拆分的是YFP熒光蛋白,，NanoBiT拆分的是螢光素酶-NanoLuc? Luciferase,，由于NanoLuc分子量小，光信號強,，表達效率高,，非特異性自發(fā)光背景低，并且標簽蛋白結(jié)合是可逆的,，所以這個方法較BIFC有很多優(yōu)勢,。但是，它需要配對的底物,，并且這個底物還不便宜,，需要大量使用的話要考慮好經(jīng)濟問題。

這個方法與FRET相比,，不需要激發(fā)光，背景更低,；不需要漂白,，細胞損壞更少；同時也避免了自發(fā)熒光干擾,；作為供體的NanoLuc螢光素酶蛋白分子量小,，更適合融合蛋白表達構(gòu)建，并且光信號強,。但是,，它需要配對的底物,，并且這個底物還不便宜,，需要大量使用的話要考慮好經(jīng)濟問題,。

SNAP或CLIP的熒光染料標記的底物不能進入細胞,，細胞內(nèi)部不會有信號產(chǎn)生而對實驗產(chǎn)生干擾,；同時也只能研究蛋白表面的蛋白結(jié)合。因為熒光染料是外接的,，所以會比內(nèi)源表達的光強要強,。均相檢測，可用于高通量篩選,。

好了,，今天就介紹到這里，對于醫(yī)生朋友來說,，熟練掌握前4種方法,，包括原理和protcol，寫標書應(yīng)該夠了,，如果大家想寫后面幾種也是可以的,，有興趣的可以了解一下這些方法的原理。

最后祝愿大家,，寫標書快樂,，寫標書不開心也是一天，開心也是一點,，不如.....不寫了吧,。