ELISA：全稱叫酶聯(lián)免疫吸附試驗,，其原理就是：測定時，受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng),，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與溶液中的其他物質(zhì)分開,，再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)結(jié)合在固相載體上,，加入酶反應(yīng)的底物后,，底物被酶催化成有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中要檢測的目標物質(zhì)的量直接相關(guān),，故可根據(jù)顏色的深淺進行定性或定量分析,。

試劑,、儀器：包括3個必要試劑和其他的試劑、儀器

3個必要試劑：

（1）固相的抗原或抗體

常用的固相載體是聚苯乙烯,，具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能,，并且抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。將抗原或抗體固定在聚苯乙烯的過程即‘包被’,，2者通過物理吸附相結(jié)合,。

（2）酶標記的抗原或抗體

制備結(jié)合物時所用純度較高的lgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其他雜蛋白的干擾,。

（3）酶反應(yīng)的底物

其他的試劑,、儀器：

操作步驟：用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法（eg：ELISA雙抗體夾心法測定培養(yǎng)上清中IFN-γ水平）

1）包被：取空白 96 孔板，按 COA 用 PBS 稀釋捕獲抗體,，每孔 100μl捕獲抗體工作液,，室溫過夜；

 2）洗板：每孔 350μl洗液,，洗板 3 次,；

3）封閉：加入封閉液 200 μL/孔封閉 ELISA 板，室溫孵育 1h,；

4）洗板：甩去板中的封閉液體,，加入洗液 350μL/孔，洗板 3 次,；

6）加樣：取出包被封閉好的 96 孔板,，分別加入 100μl標準品或稀釋好的樣品，標準品做復(fù)孔,，室溫孵育 2h,；

7）洗板：每孔 350μl洗液，洗板 3 次,；

8）加酶標抗體：按 COA 用稀釋液稀釋檢測抗體,，每孔 100μl檢測抗體工作液，室溫孵育 2h,；

9）洗板：每孔 350μl洗液,，洗板 3 次,；

10）加入底物：每孔 100μl顯色液,，室溫避光孵育 20min，連續(xù)觀察顏色變化,；

11）加終止液：每孔 50μl終止液,，輕柔混勻；

12）讀板：檢測根據(jù)酶標儀器操作方法,，上機檢測 OD值,，通過計算獲得所測物質(zhì)的濃度,。

注意事項：

1、  樣本采集和保存：應(yīng)避免溶血,、脂血標本,，容易產(chǎn)生非特異性顯色干擾；

2,、  ELISA中用的蒸餾水或去離子水,，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的,；

3,、  加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免在孔壁上部,，并注意不要濺出及產(chǎn)生氣泡,；

4、  最好用微孔板振蕩器進行洗滌,。

數(shù)據(jù)處理：

1,、在EXCEL表格中整理ELISA前期數(shù)據(jù)：標準值用來求標準曲線，根據(jù)標準曲線求樣本值的濃度：

2,、打開軟件,，ELISACalc，界面如下：

3,、選擇回歸/擬合模型,，根據(jù)購買的試劑盒決定，這里以四參數(shù)為例

4,、扣除本底,，也就是blank的值，并且對X,、Y軸命名

5,、點擊“復(fù)制”按鈕，將EXCEL表格中的數(shù)值進行復(fù)制,，并點“粘貼”按鈕,，粘貼在ELISA Calc表格中

6、點擊“回歸/擬合”,，出現(xiàn)曲線,，并可根據(jù)r2大小判斷曲線的擬合程度，越接近1,，擬合程度越好,。

7.標準曲線已知，并且Y軸是吸光值,，X軸是濃度,，樣本值的吸光值是已知的,，要根據(jù)標準曲線求濃度，也就是“由Y計算X”

8,、復(fù)制,、粘貼樣本的OD值，軟件直接自動計算出對應(yīng)的濃度值,，點擊“復(fù)制”,，可將計算出的數(shù)據(jù)粘貼到EXCEL表格中，進行后續(xù)作圖分析,。

處理素材下載鏈接：https://pan.baidu.com/s/1hxMWmGYd0FhVLDDA8Llbcw

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