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ELISA實(shí)驗(yàn)中不容忽視的細(xì)節(jié)盤(pán)點(diǎn),,值得收藏!

 余舍我的圖書(shū)館 2017-06-13


ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。但ELISA測(cè)定中影響因素較多,,而且其操作中有一定的技術(shù)要求,,在檢測(cè)過(guò)程中除正常反應(yīng)外,有時(shí)常見(jiàn)到一些錯(cuò)誤的結(jié)果,。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有:①標(biāo)本因素;②試劑因素,;③操作因素,。下面就一些常見(jiàn)ELISA操作過(guò)程中的問(wèn)題一一分析。


樣品稀釋


酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng),,如果血清不稀釋,,不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng),出現(xiàn)假陽(yáng)性,。因此,,國(guó)外檢測(cè)血清抗體的試劑盒,均規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù),,以降低非特異性反應(yīng),,使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來(lái),。一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過(guò)大量試驗(yàn)確定,以保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性,。但是,,有些用戶未能嚴(yán)格按使用說(shuō)明書(shū)操作,如某些產(chǎn)品應(yīng)取10μl樣品進(jìn)行稀釋,,個(gè)別用戶取5μl甚至1μl樣品進(jìn)行稀釋,,由于吸嘴上不可避免地沾有樣品以及微量移液器的精度不夠,因此造成樣品稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確,,檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)問(wèn)題,。


試劑盒平衡 


試劑盒中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗(yàn)前平衡至室溫(約25℃),一般需在室溫放置20~30分鐘以上,。平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠,,樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短,ELISA反應(yīng)不夠充分,。冬季室溫低,,可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。


樣品和試劑的混勻


稀釋前,、后的樣品必須充分混勻,,所有試劑在加樣前也須搖勻,以保證試驗(yàn)的均一性,。


加樣


在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中,,必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關(guān)鍵點(diǎn)是:加樣不可太快,,要避免加在孔壁上部,,不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快,,無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性,。加在孔壁上部的非包被區(qū),易導(dǎo)致非特異吸附,。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染,。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。所以,,有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測(cè)定為陽(yáng)性,,下次測(cè)定為陰性,往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致,。


溫育


溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素,。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定,抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行,,要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合,,必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比,,即溫度越高,,則所需時(shí)間相對(duì)較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫,,其次是43℃和2~8℃,。一些操作者,擅自改變說(shuō)明書(shū)操作,,使用自己喜歡的溫育時(shí)間和溫育溫度,,這樣造成一些不必要的麻煩。因?yàn)?,不同試劑盒有不同的溫育時(shí)間和溫育溫度的選擇,,隨意更改溫育時(shí)間或者溫育溫度將導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。


洗板 


固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相免疫測(cè)定技術(shù),,需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過(guò)程中吸附的非特異成份分離開(kāi)來(lái),,以保證ELISA測(cè)定的特異性。洗板對(duì)于ELISA測(cè)定來(lái)說(shuō),,也是極其關(guān)鍵的一步,。洗液盡量不要溢出孔外;加洗液后要靜置1分鐘,,甩去板孔中洗液后,,一定要大力拍干;及時(shí)更換吸水紙,,尤其是拍過(guò)酶標(biāo)記物的吸水紙一定要棄去,,否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果。


邊緣效應(yīng)


使用96孔板的ELISA測(cè)定中,,常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”,,即外周孔顯色較中心孔深。經(jīng)研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所,。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體,,在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中,將板從室溫(通常在25℃左右)置于37℃溫箱,,板也升溫時(shí),,在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí),,將板和溶液均加熱至溫育溫度(如37℃),,就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”,并且可提高測(cè)定的重復(fù)性,。


顯色


顯色一定要控制時(shí)間,根據(jù)試劑盒說(shuō)明操作即可,。一般來(lái)說(shuō),,顯色時(shí)間過(guò)短,結(jié)果偏低,;顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng),,空白增高或者非特異性顯色增加。

 

比色


比色要注意波長(zhǎng)的選擇,。以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用,,而前者比色波長(zhǎng)為450nm,后者為492nm,,濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換,。因此,容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問(wèn)題,。


其次,,單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)比色選擇的問(wèn)題。所謂的單波長(zhǎng)比色即是通常的以對(duì)顯色具有最大吸收的波長(zhǎng)如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定,;而雙波長(zhǎng)雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如450nm和非敏感波長(zhǎng)如630nm下各測(cè)定一次,,敏感波上下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕,、灰塵等臟物所致的吸光度之和,;非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定即改變波長(zhǎng)至一定值,使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零,,此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值,。最后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長(zhǎng)下的吸光度值與非常感波長(zhǎng)下的吸光度值的差。因此,,雙波長(zhǎng)比色測(cè)定具有能排除由微滴板本身,、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋,、刮痕,、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn)。由于ELISA測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性,,也就是說(shuō)每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值,,故而在ELISA測(cè)定比色時(shí),最好是使用雙波長(zhǎng)比色,。


綜上所述:盡管ELISA測(cè)定的操作步驟非常簡(jiǎn)單,,但有可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的因素卻較多,分布在測(cè)定操作的各步之中,,尤以加樣,、溫育和洗板為甚。


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