今天我們通過介紹一篇Cell文章,，說一個有意思的現(xiàn)象：SNP位點可同時作為啟動子和增強子,，其轉(zhuǎn)換由基因型決定，結(jié)果是一個基因產(chǎn)生不同的RNA,，從而參與疾病發(fā)生發(fā)展,。

Risk SNP-Mediated Promoter-Enhancer Switching Drives Prostate Cancer through lncRNA PCAT19.Cell 2018 Jul 26;174(3)

風(fēng)險SNP介導(dǎo)的啟動子/增強子轉(zhuǎn)化通過lncRNA PCAT19促進前列腺癌發(fā)生發(fā)展，這里我們關(guān)注幾個關(guān)鍵詞：SNP位點,、啟動子,、增強子、lncRNA PCAT19和前列腺癌,。

增強子的概念在昨天的文章里面介紹過——科研新思路：基因DNA獨立于RNA發(fā)揮作用

增強子是能夠增加啟動子活性從而增加基因轉(zhuǎn)錄頻率的DNA序列,。

下面我們直接看文章。

一,、SNP位點rs11672691與患者預(yù)后及l(fā)ncRNA PCAT19表達關(guān)系

首先前期GWAS分析報道SNP位點rs11672691與前列腺癌風(fēng)險和患者死亡率相關(guān),，接下來研究團隊對CPC-GENE研究中的127位患者的RFS和SNP的基因型進行分析,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GG基因型患者生存率顯著更低：

接下來通過eQTL分析SNP基因型與1-Mbp內(nèi)基因表達的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與lncRNA PCAT19最相關(guān)：

由于lncRNA PCAT19有多個異構(gòu)體,，其中前列腺癌中表達最高的是兩條lncRNA PCAT19-short和lncRNA PCAT19-long：

注意箭頭處的不同轉(zhuǎn)錄起始位點TSS。

接下來eQTL分析發(fā)現(xiàn)SNP基因型與short和long的相關(guān)性正好相反：

G/G型 short表達低,；long表達高

這樣就把已經(jīng)報道的前列腺癌風(fēng)險位點與lncRNA的不同異構(gòu)體的表達建立起來了聯(lián)系。

二,、位于short啟動子的非風(fēng)險位點更偏重被轉(zhuǎn)錄因子NKX3.1和YY1結(jié)合

首先看一下SNP位點與lncRNA的關(guān)系：

紅色箭頭指的是rs11672691和 LD SNP rs887391位點的位置,，我們可以看到其位于short啟動子上游和long的（第三）內(nèi)含子。

而這個位置正好是轉(zhuǎn)錄因子NKX3.1和YY1的結(jié)合區(qū)域,，且Chip-seq實驗也發(fā)現(xiàn)兩個轉(zhuǎn)錄因子更偏重與非風(fēng)險序列結(jié)合：

圖中紅色箭頭指的是兩個轉(zhuǎn)錄因子的偏好性,，我們可以看到兩個轉(zhuǎn)錄因子更偏好于結(jié)合非風(fēng)險的序列,。

三,、SNP位點通過介導(dǎo)啟動子/增強子轉(zhuǎn)換調(diào)控異構(gòu)體表達

前面已經(jīng)證明了兩個轉(zhuǎn)錄因子更偏重結(jié)合非風(fēng)險位點，而非風(fēng)險基因型與兩條lncRNA異構(gòu)體的表達關(guān)系是：short表達更高,，而long表達低。兩個轉(zhuǎn)錄因子進行的基因沉默也證實了short的表達顯著降低,，而long則出現(xiàn)了表達升高：

結(jié)果中轉(zhuǎn)錄因子沉默導(dǎo)致short表達降低可以說明轉(zhuǎn)錄因子對short啟動子結(jié)合介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,；而對long的影響原因是不清楚的,。

接下來,，通過CRISPRi和CRISPRa分別干預(yù)SNP位點（位于short的啟動子區(qū)域），結(jié)果是long的表達分別降低和升高,，而short的表達也是降低和升高：

這里的結(jié)果就有意思了：對short來說啟動子的活化表達導(dǎo)致其表達升高,，可導(dǎo)致long升高是怎么回事呢？

進一步的,，根據(jù)Roadmap Epigenomics（前期研究）和Chip-seq的結(jié)果，研究團隊發(fā)現(xiàn)SNP位點具有啟動子和增強子的組蛋白修飾（H3K4me3和H3K4me1 ）

特性（下圖紅框）,，因此推測SNP位點通過不同基因型介導(dǎo)啟動子和增強子轉(zhuǎn)換：

下面就是驗證這個推測了,，用到的是熒光素酶報告基因來檢測啟動子和增強子的活性（luciferasebased promoter and enhancer assays）,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)風(fēng)險位點有更高的增強子活性，而非風(fēng)險位點有更高的啟動子活性：

前面我們已經(jīng)證明了SNP位點所在位置是short的啟動子發(fā)揮作用,，下面進一步來證明這個位點在的區(qū)域作為long的增強子。首先分析了DHS信號 (DNase I hypersensitive, 染色體開放區(qū)域的一個指標)與long啟動子的相關(guān)性,，接下來通過3C實驗（chromosome conformation capture 3C assay）結(jié)果發(fā)現(xiàn)long 啟動子與SNP位點所在區(qū)域有更強作用,，且作用富集在SNP位點：

到這里,，這篇文章中的一個關(guān)鍵問題就解決了：前列腺癌風(fēng)險位點SNP位點通過不同基因型介導(dǎo)所在區(qū)域作為lncRNA PCAT19的啟動子和增強子調(diào)控兩者表達，對應(yīng)關(guān)系是：SNP風(fēng)險位點——long的增強子活性——long高表達,；SNP非風(fēng)險位點——short的啟動子活性——short高表達,。

四、lncRNA PCAT19 long通過活化細胞周期基因促進前列腺癌

上面這個問題解決后,，下面就是long的的功能和下游機制了,。

功能上用了三種敲減技術(shù)：siRNA，ASO和shRNA,，從體內(nèi)和體外研究細胞的增殖,、侵襲遷移能力：

細胞和動物實驗發(fā)現(xiàn)long促進前列腺癌進展

初步機制上，先通過RNA-seq找差異基因,，GO分析顯示細胞周期被最顯著富集,；接下來TCGA數(shù)據(jù)分析long表達與細胞周期基因關(guān)系、患者預(yù)后關(guān)系,；最后檢測long敲減后周期基因表達：

這一步解決的問題是long發(fā)揮作用的下游機制初步探索,，明確的是long調(diào)控的作用通路（細胞周期）和基因，但沒有解決的是long的直接作用靶點,。

具體靶點的確定：首先做long的細胞定位,，發(fā)現(xiàn)定位與細胞核,；接著是long的RNA pulldown+質(zhì)譜/WB檢測和CHIRP（chromatin isolation by RNA pull-down）驗證,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)作用蛋白是HNRNPAB；再通過RIP反向驗證：

HNRNPAB與long直接結(jié)合

long通過HNRNPAB發(fā)揮作用：HNRNPAB與long直接結(jié)合不等于long通過HNRNPAB發(fā)揮功能,，所以從表型和靶基因調(diào)控的類似性說明：

（1）HNRNPAB對前列腺癌的表型影響與long類似,；

（2）HNRNPAB與long調(diào)控的靶基因類似：

最后是整篇文章作用機制的示意圖：

到這里這篇文章就介紹好了，下面我們來說一個問題：SNP的研究還有沒有創(chuàng)新性,？

很多人說SNP的研究已經(jīng)做了這么多年,，沒有創(chuàng)新性了，這個問題要看你怎么考慮,。在這篇文章中SNP與lncRNA基因的啟動子和增強子結(jié)合起來發(fā)的是Cell雜志,；如果沒有SNP介導(dǎo)的啟動子/增強子轉(zhuǎn)換這個部分的工作，就只看這篇文章中l(wèi)ncRNA PCAT19的工作量的話,，文章很難超過10分，甚至5分都難,。

另外,，我們以前推過另外一篇文章：一篇22分的NG教你如何設(shè)計課題,，這篇文章中SNP也是與lncRNA聯(lián)合起來研究的，只不過SNP位點位于lncRNA內(nèi)部,，對lncRNA的影響也是影響到lncRNA的不同作用方式：

所以我個人認為：只有外行才會說一個方向沒有創(chuàng)新性了，不是沒有,，是你不知道怎么做,。