【作 者】鄭溜豐

【學(xué)位授予單位】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

【學(xué)位名稱】博士

【導(dǎo)師姓名】彭健

【學(xué)位年度】2017

【關(guān)鍵詞】仔豬；低蛋白日糧,；支鏈氨基酸,；采食量；骨骼肌生長,；蛋白質(zhì)合成與降解,；氨基酸代謝

【摘 要】

充足的底物濃度和平衡的氨基酸模式是豬骨骼肌高效蛋白質(zhì)合成的必要條件。其中,采食量是保障充足的底物濃度的關(guān)鍵,。除作為合成蛋白質(zhì)底物外,支鏈氨基酸（branched chain amino acids,BCAAs）（包括亮氨酸,、異亮氨酸、纈氨酸）可能還發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用,。比如,纈氨酸能夠調(diào)控豬采食量,。此外,幾乎所有谷氨酸和天冬氨酸以及大部分谷氨酰胺在腸道發(fā)生了分解代謝,導(dǎo)致不可逆的損失。骨骼肌蛋白質(zhì)合成所需的這三個非必需氨基酸必須要由BCAAs代謝生成,。而且BCAAs僅有部分被腸道和肝臟等器官截留,。因此,通過日糧中添加BCAAs可能增加骨骼肌內(nèi)自身代謝生成谷氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸,優(yōu)化胞內(nèi)氨基酸模式,促進蛋白質(zhì)合成,。目前已有的研究表明,日糧添加BCAAs可以提高豬生長性能,但其對采食量及骨骼肌蛋白質(zhì)沉積的調(diào)控機制尚待進一步闡明,。

本研究圍繞BCAAs提高仔豬采食及骨骼肌生長的關(guān)鍵問題,通過兩輪仔豬飼養(yǎng)試驗證實了低蛋白日糧添加BCAAs通過提高采食量和直接促進肌肉生長,改善仔豬生長性能,并進一步闡明了下丘腦感應(yīng)BCAAs調(diào)節(jié)仔豬采食量的機制,。應(yīng)用血插管結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù),研究了日糧BCAAs對攝食狀態(tài)下骨骼肌的氨基酸凈利用及代謝的影響,并探究了BCAAs代謝與肌肉氨基酸凈利用的關(guān)系;應(yīng)用血插管結(jié)合穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù),進一步闡明了BCAAs通過自身代謝調(diào)控骨骼肌蛋白質(zhì)合成的機制。最后研究了日糧BCAAs對禁食狀態(tài)下骨骼肌內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成與降解的信號通路活性的影響,。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:

第一部分:通過兩輪仔豬飼養(yǎng)試驗研究了低蛋白日糧添加BCAAs對仔豬生長性能,、采食量及骨骼肌生長的影響。

在試驗一中,選取28頭斷奶仔豬分為4個組,即正對照組,、負(fù)對照組,、試驗1組以及試驗2組,日糧粗蛋白水平依次為19.5%、16.7%,、16.7%和17.2%,。其中,試驗1組在負(fù)對照組基礎(chǔ)上添加纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸保證日糧中三種BCAAs水平與正對照組一致,并增加一倍的添加劑量形成試驗2組的日糧,。自由采食,。

試驗二為配對試驗,選取21頭斷奶仔豬分為3個組,即負(fù)對照組、試驗1組以及配對組,。其中,負(fù)對照組和試驗1組同試驗一,。配對組試豬飼喂試驗1組的日糧,但采食量與負(fù)對照組保持一致。28 d的飼養(yǎng)試驗結(jié)束后,每組隨機選擇6頭屠宰,測定胴體性狀,采集下丘腦及背最長肌樣,。同時,剝離背最長肌等主要的23塊肌肉,分別稱量肌肉塊重量,。

主要結(jié)果如下:

1.與負(fù)對照組相比,試驗1組和試驗2組顯著提高了平均日增重、末重,、采食量,、前軀、中軀和后軀肌肉總重,、背最長肌等大多數(shù)肌肉塊重量以及氮沉積（P<><><>

2.與負(fù)對照組相比,日糧添加BCAAs以劑量依賴的方式上調(diào)下丘腦Agrp和NPY mRNA水平,下調(diào)MC4R mRNA水平,并在試驗2組達到差異顯著水平（P<0.05）,。此外,試驗1組顯著下調(diào)了cart><0.05）?；貧w分析顯示,采食量隨npy mrna水平增加呈二次曲線增加（p="0.02）,而隨MC4R" mrna水平增加呈線性降低（p="">

3.與負(fù)對照組相比,試驗1組和試驗2組顯著降低了下丘腦eIF2α磷酸化水平,以及顯著提高了S6K1磷酸化水平（P<><>

4.與負(fù)對照組相比,試驗1組和配對組均顯著提高了背最長肌S6K1和mTOR磷酸化水平（P<>

第二部分:利用血插管結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)研究了日糧添加BCAAs對仔豬肌肉氨基酸凈利用和股靜脈代謝產(chǎn)物譜的影響,。試驗動物同第一部分的配對試驗。28 d的飼養(yǎng)試驗結(jié)束后,對負(fù)對照組及試驗1組的試豬分別在股動脈,、股靜脈,、頸動脈和頸靜脈安裝插管,。在術(shù)后的第5 d,每組各選擇6頭健康且插管通暢的試豬進行正式試驗,。通過股動脈持續(xù)9 h灌注對氨基馬尿酸（pAH）以測定肌肉血流速度。每隔1 h飼喂以保持試豬始終處于攝食狀態(tài),連續(xù)飼喂8次,。攝食前及攝食后每隔1 h分別采集頸動脈和股靜脈血樣以供分析pAH,、游離氨基酸及支鏈α酮酸,連續(xù)采集8次。待血樣采集完成后屠宰,采集股二頭肌樣用于游離氨基酸及3-甲基組氨酸分析,股靜脈血樣同時進行代謝組學(xué)分析,。

主要結(jié)果如下:

1.肌肉血流速度在攝食后顯著提高了（P<><><><>

2.日糧添加BCAAs顯著提高了總BCAAs,、總必需氨基酸,、總非必需氨基酸及總氨基酸的肌肉凈利用量（P<><><>

3.日糧添加BCAAs對股靜脈代謝物有顯著影響,這些差異化合物與BCAAs代謝和蛋白質(zhì)合成相關(guān)。例如,添加BCAAs顯著提高了三種支鏈α酮酸,、谷氨酰胺以及天冬酰胺等代謝產(chǎn)物含量（P<><><>

4.肌肉氨基酸凈利用量分別與動脈的亮氨酸,、異亮氨酸及纈氨酸濃度呈顯著正相關(guān)（P<><>

第三部分:利用血插管結(jié)合穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)研究了日糧BCAAs通過調(diào)控自身代謝影響仔豬骨骼肌蛋白質(zhì)合成與降解的機制。攝食狀態(tài)下機制研究的試驗動物同第二部分試驗,。在試豬第一次采食完,通過頸靜脈灌注NaH¹³CO₃,持續(xù)2 h,。隨后灌注[1-¹³C]亮氨酸,持續(xù)6 h。pAH灌注以及血樣采集同第二部分試驗,。血樣用于分析亮氨酸,、KIC和CO₂濃度及其同位素豐度。禁食狀態(tài)下機制研究的試驗動物同第一部分試驗的試驗一,。采集負(fù)對照組和試驗1組的背最長肌樣,。

主要結(jié)果如下:

1.日糧添加BCAAs顯著提高亮氨酸的動脈攝入量和凈利用量（P<><><><>

2.肌肉的[1-¹³C]亮氨酸凈攝取以及[1-¹³C]KIC凈生成在日糧添加BCAAs后也顯著提高了（P<>¹³C]KIC凈生成之間呈顯著正相關(guān)（P<>

3.日糧添加BCAAs顯著提高了背最長肌的Akt、mTOR及其下游靶蛋白S6K1的磷酸化水平（P<><><>

本研究的主要結(jié)論為:

（1）低蛋白日糧添加BCAAs可以提高采食量以及直接促進肌肉生長,從而改善仔豬生長性能,并能恢復(fù)到飼喂高蛋白日糧的水平;

（2）日糧BCAAs可以通過影響下丘腦的食欲調(diào)節(jié)基因表達及通路活性,提高采食量;

（3）日糧BCAAs通過促進自身在肌細胞內(nèi)的代謝以及蛋白質(zhì)降解,進而增加氨基酸凈利用量,提高攝食狀態(tài)下骨骼肌蛋白質(zhì)合成速率;同時,日糧BCAAs通過下調(diào)泛素-蛋白酶體以及自噬-溶酶體途徑的關(guān)鍵蛋白表達,抑制禁食狀態(tài)下骨骼肌蛋白質(zhì)降解,并最終提高蛋白質(zhì)沉積,從而促進骨骼肌生長,。