|
目前,，隨著成本的降低，二代測(cè)序技術(shù)在遺傳學(xué)及醫(yī)學(xué)中的研究和應(yīng)用越來越普遍,。得益于不同方式的測(cè)序(panel/WES/WGS）,以及大樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)的積累,，大量的致病基因及位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，極大的促進(jìn)了相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)發(fā)現(xiàn),也使基因檢測(cè)日益成熟,。其中,，如何從測(cè)序數(shù)據(jù)中準(zhǔn)確的進(jìn)行變異檢測(cè)，是后續(xù)生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究的基礎(chǔ),。變異位點(diǎn)通常包括：點(diǎn)突變（SNV）,，短的插入缺失（Indel），拷貝數(shù)變異（CNV）及結(jié)構(gòu)變異（SV）等,。不同的變異類型的變異檢測(cè)方法和準(zhǔn)度均存在差異,。本文主要從三個(gè)方面論述變異位點(diǎn)的相關(guān)問題： 通常,，Sanger等一代測(cè)序技術(shù)作為金標(biāo)準(zhǔn),，用于對(duì)二代測(cè)序的位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。但是由于人類基因組變異位點(diǎn)的數(shù)量極為龐大,，對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行大規(guī)模的驗(yàn)證是不可取的,。那么，對(duì)于一個(gè)變異數(shù)據(jù)集如何從整體上評(píng)估其變異的可信度,？主要有兩個(gè)指標(biāo)： 1）針對(duì)SNP的變異類型,，即轉(zhuǎn)換(Ti)/顛換(Tv)的比例，研究表明Ti/Tv=2.1:1[1],，即存在一定的偏好性,；根據(jù)某一SNP變異集的Ti/Tv值偏離此范圍之程度，來判斷其可信度,； 2）判斷變異集合中屬于dbSNP數(shù)據(jù)庫之比例,；通常認(rèn)為，對(duì)于某一個(gè)個(gè)體,，檢測(cè)的變異位于dbSNP[2]中,，則其可信度較高；而新位點(diǎn)（novel variants）則暗示著較大比例的假陽性。 雖然有綜述文章[3]表明主流的測(cè)序平臺(tái)正確率極高（99.99%~99.9999%）,，然而,，由于人類基因組堿基數(shù)目的巨大，進(jìn)而導(dǎo)致識(shí)別的堿基錯(cuò)誤的絕對(duì)數(shù)量仍較為龐大,；Li Heng[4]通過一個(gè)單倍體CHM1hTERT的65x的測(cè)序數(shù)據(jù),，同時(shí)，還采用Illumina Platinum Gen omes project的NA12878作為陽性對(duì)照（55x）,，在考慮體細(xì)胞突變的情況下,，發(fā)現(xiàn)雜合位點(diǎn)假陽性的概率約為：1~100–200 kb；(即在全基因組水平上15000-30000的假陽性雜合位點(diǎn)),?？傊鷾y(cè)序同時(shí)有準(zhǔn)確度高和假陽性和假陽性絕對(duì)數(shù)量大的特點(diǎn) 構(gòu)建人類個(gè)體的標(biāo)準(zhǔn)變異數(shù)據(jù)集,，在評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量、變異檢測(cè)流程準(zhǔn)確度方面有重要的作用,。目前,，普遍使用的真實(shí)變異數(shù)據(jù)集為NA12878個(gè)體的兩套標(biāo)準(zhǔn)變異數(shù)據(jù)集： 1）National Institute of Standards and Technology (NIST)組織開展的的Genome in a Bottle Consortium計(jì)劃中，Zook J M等人采用Illumina,，454,，SOLiD4，Complete Genomics,，Ion Torrent共 5種測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣本NA12878進(jìn)行測(cè)序,，利用7種比對(duì)方法以及3種變異檢測(cè)工具組合而得到的14個(gè)數(shù)據(jù)集（11個(gè)全基因組和3個(gè)全外顯子組），通過整合多種平臺(tái)和數(shù)據(jù)庫來確定SNP和INDEL變異位點(diǎn)的置信程度,，提供了一個(gè)高置信的變異位點(diǎn)集[5],。然而，該數(shù)據(jù)集不包括約23%的基因組部分,。此外,，該研究仍在進(jìn)行基于種群的高置信變異位點(diǎn)構(gòu)建工作。 2）Illumina Platinum Project:該計(jì)劃對(duì)CEPH 1463家系的17個(gè)成員分別采用Hiseq 2000進(jìn)行50x測(cè)序,。此外,，對(duì)NA12877, NA12878及NA12882 trio家系還進(jìn)行了200x 的HiSeq 2000測(cè)序其中，建庫技術(shù)為TruSeq DNA PCR-Free Library Prep Kit,；并采用多種生物信息分析流程來進(jìn)行變異檢測(cè),，最終的高置信變異集合綜合考慮了家系遺傳和多種方法的結(jié)果而得。同時(shí)提供了NA12877 和NA12878兩個(gè)個(gè)體的標(biāo)準(zhǔn)變異數(shù)據(jù)集,。 影響變異檢測(cè)的因素是多方面的,，涵蓋了從實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)到信息分析環(huán)節(jié)： 目前主要是選擇全外顯子組測(cè)序（WES）還是全基因組測(cè)序（WGS）。一項(xiàng)基于WGS和WES的比較研究[10]發(fā)現(xiàn)：WGS對(duì)編碼區(qū)有更好的捕獲效率,；以覆蓋度20x為標(biāo)準(zhǔn),，95-160x的高測(cè)序深度的WES可以捕獲95%的編碼區(qū)域；而87x的WGS捕獲率即為98%,。目前，隨著測(cè)序成本的降低,，WGS越來越成為科學(xué)研究中的主流方案,。 不同的測(cè)序平臺(tái)，在reads讀長(zhǎng),、堿基的識(shí)別方面均有差異,。其中，Illumina平臺(tái)易出現(xiàn)替換錯(cuò)誤（substitution errors）,，同時(shí)由于單鏈DNA的折疊和酶的堿基序列偏好性修飾導(dǎo)致一些序列特異性錯(cuò)誤,。單分子的Pacific Bioscience雖然有讀長(zhǎng)長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，但易導(dǎo)致indel錯(cuò)誤,，而基于焦磷酸和半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)則在homopolymer易出現(xiàn)延后的indel錯(cuò)誤[3],。J F等人比較了一個(gè)trio家系在Illumina HiSeq，Life Technology Proton和Complete Genomics三個(gè)測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序一致性,，結(jié)果（見圖1）顯示三者在SNP的檢測(cè)上僅有66%的一致性,，而在Indel上僅有18%的一致性[6]?？傊?，各個(gè)平臺(tái)技術(shù)均有所優(yōu)劣，目前主流的為Illumina平臺(tái),，而國(guó)產(chǎn)的華大BGIseq序列的使用也較為普遍,。 基于Genome in a Bottle (GIAB) 聯(lián)盟提供的NA12878標(biāo)準(zhǔn)變異數(shù)據(jù)集，Sohyun Hwang[7]對(duì)12種測(cè)序數(shù)據(jù),，系統(tǒng)比較了BWA-MEM, Bowtie2以及Novoalign三種比對(duì)工具,，以及GATK-HC，Samtools,，F(xiàn)reebayes,，Torrent Variant Caller (TVC)四種call變異軟件組成的13種分析流程在變異檢測(cè)結(jié)果上的不同；其中,，12種數(shù)據(jù)集信息見下表： 結(jié)果表明,，各種分析流程在變異檢測(cè)的敏感性和特異性方面均有所差異。建議采用主流的BWA-GATK流程進(jìn)行變異檢測(cè),，同時(shí)綜合其他分析流程的結(jié)果,。 總之，目前的變異檢測(cè)方案是比較成熟的，適合大規(guī)模的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用,。但是,，進(jìn)一步提高變異檢測(cè)的準(zhǔn)確度，降低假陽性和假陰性比例,，仍需要新的測(cè)序技術(shù)和變異檢測(cè)工具的開發(fā),。 |
|
|
