一,、目的與要求

1,、學(xué)習(xí)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的原理。

2,、掌握凱氏定氮法的操作技術(shù),，包括樣品的消化處理、蒸餾,、滴定及蛋白質(zhì)含量計算等,。

二,、實驗原理

1、消解：蛋白質(zhì)是含氮的化合物,。食品與濃硫酸在催化劑作用下共同加熱消化,，使蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨而留在消化液中,，然后加堿蒸餾使氨游離,，用硼酸吸收后，再用鹽酸標準溶液滴定,，根據(jù)酸的消耗量來乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù),，即得蛋白質(zhì)含量。因為食品中除蛋白質(zhì)外,，還含有其它含氮物質(zhì),，所以此蛋白質(zhì)稱為粗蛋白。

濃硫酸將有機物炭化后為碳氫與氮,，將形成的碳氧化：

生成的二氧化硫?qū)⒀趸瘧B(tài)的氮還原為氨而自身被氧化為三氧化硫,，氨隨之與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨，

在消解試驗中,，為了加速蛋白質(zhì)的分解,，縮短消解時間，常常加入下列物質(zhì)：

（1）硫酸鉀：一般濃硫酸的沸點為340℃,，但加入硫酸鉀后,，硫酸不斷分解，水不斷溢出引起硫酸鉀濃度不斷增加,，沸點因此而增加,。

但硫酸鉀濃度不能太大，否則消化溫度過高會引起銨鹽的熱分解而釋放出氨,，

除了可以添加硫酸鉀之外,，也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等以提高溶液溫度,，但效果要差于硫酸鉀,。

（2）硫酸銅：硫酸銅可以催化反應(yīng)?？梢圆捎玫拇呋瘎┏肆蛩徙~外,，還可以加入氧化汞、汞,、硒粉以及二氧化鈦等,，但考慮效果、價格以及污染等原因外,，最常用的還是硫酸銅,，同時可以加入少量的過氧化氫,、次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機物的氧化，反應(yīng)機理為：

此反應(yīng)不斷進行,，如溶液沒有褐色生成（Cu2SO4）顏色而呈現(xiàn)清澈的藍綠色,，說明有機物已經(jīng)全部被消解完畢。因此,，在試驗過程中,，硫酸銅不但能夠催化反應(yīng)，而且能夠指示反應(yīng)的進行程度,。

2,、堿化蒸餾：在消解完全的樣品溶液中加入過量的濃的氫氧化鈉溶液使溶液呈現(xiàn)堿性，加熱蒸餾而放出氨氣：

3,、吸收與滴定：將加熱蒸餾釋放出來的氨利用硼酸溶液進行吸收,，因硼酸屬于弱酸，其后再用鹽酸進行滴定：

除此之外,，也可以用過量的鹽酸或者硫酸吸收整流而出的氨氣,，然后再用氫氧化鈉進行回滴。

三,、儀器與試劑

（一）試劑

1,、硫酸銅（CuSO4·5H20）；

2,、硫酸鉀；

3,、濃硫酸（密度為1.84g/ml）,；

4、硼酸溶液（20 g/L）,；

5,、氫氧化鈉溶液（400 g/L）；

6,、0.01mol/L 鹽酸標準滴定溶液,；

7、混合指示試劑：0.1%甲基紅乙醇溶液液：0.1%溴甲酚綠乙醇溶液=1:5,。

（二）儀器

微量定氮蒸餾裝置：凱氏燒瓶,，如圖所示。

四,、實驗步驟

1,、樣品消化

稱取固體樣品0.2-2.0g（半固體2-5g，液體樣品10-20ml）,，移入潔凈干燥的500ml凱氏燒瓶中,，加入0.5g硫酸銅,、5g硫酸鉀與10ml濃硫酸，稍搖勻后瓶口放一小漏斗,，將瓶以45°角支于有小孔的石棉網(wǎng)上,，使用電爐，在通風(fēng)櫥中（不能瓶口對人）小火慢慢加熱消化,，開始時用低溫加熱,，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫停止后,，再升高溫度保持微沸,，消化至液體呈藍綠色澄清透明后，繼續(xù)加熱0.5h,，取下放冷,。

2、蒸餾與吸收

將凱氏定氮儀按圖示連接,，凱氏瓶中加入數(shù)粒玻璃珠（或沸石）以防暴沸,，小心加10ml水，

放冷后再加入70ml的NaOH溶液,，在吸收瓶中加入30ml的硼酸吸收液并加入2-3滴混合指示劑,，開始加熱，打開冷凝水,，設(shè)置蒸餾時間為210s,。將冷凝管下端提離液面，并用蒸餾水沖洗管口,。

3,、將上述吸收液用0.1000mol/L的鹽酸標準溶液進行滴定，溶液由藍色變?yōu)槲⒓t即為終點,，記錄鹽酸用量,。做空白試驗，記錄相應(yīng)消耗的鹽酸體積,。

五,、結(jié)果計算

六、注意事項及說明

1,、消化時,，若樣品含糖高或含脂及較多時，注意控制加熱溫度,，以免大量泡沫噴出凱氏燒瓶,，造成樣品損失，可加入少量辛醇或液體石蠟,，或硅消泡劑減少泡沫產(chǎn)生,。

2,、消化開始時，不能用強火,，應(yīng)該慢慢加熱,，防止暴沸或樣品粘附于瓶壁而消解不完全。為此,，消化時應(yīng)注意旋轉(zhuǎn)凱氏燒瓶,，將附在瓶壁上的碳粒沖下，對樣品徹底消化,。

3,、若樣品不易消化至澄清透明，可將凱氏燒瓶中溶液冷卻,，加入數(shù)滴過氧化氫后,，再繼續(xù)加熱消化至完全。

4,、蒸餾裝置不能漏氣,，蒸餾完畢后，應(yīng)將冷凝管下端提離液面并清洗管口,，繼續(xù)蒸餾一分鐘后再停止加熱,，否則可能造成倒吸。

5,、硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40℃,，否則氨吸收減弱，造成檢測結(jié)果偏低,?？砂呀邮掌恐糜诶渌≈小?/p>

6,、混合指示劑在堿性條件下呈綠色，中性條件下呈灰色,，酸性溶液中呈現(xiàn)紅色,。