感染性疾病至今依舊是威脅人類健康的主要疾病。規(guī)范進(jìn)行感染性疾病的診斷,、治療,、預(yù)防是救治患者的基礎(chǔ)。

雖然臨床工作中,，在明確病原菌之前,，醫(yī)生根據(jù)患者感染部位常見致病菌、嚴(yán)重程度以及是否存在耐藥細(xì)菌感染可能性開始經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療始終是救治患者的關(guān)鍵,。但毫無疑問,，無論是對后續(xù)治療進(jìn)行可能的調(diào)整還是降階梯治療的可行性評(píng)估，以及為該部位感染常見致病菌積累可靠的流行病學(xué)數(shù)據(jù),，病原學(xué)診斷均至關(guān)重要,。

做好病原學(xué)的快速、準(zhǔn)確診斷至少包括臨床微生物標(biāo)本規(guī)范采集,、送檢,、實(shí)驗(yàn)室規(guī)范操作以及新診斷技術(shù)，以彌補(bǔ)經(jīng)典培養(yǎng)方法的缺陷（特別是對新發(fā)感染性疾?。?。其中，標(biāo)本規(guī)范采集,、送檢無疑是關(guān)鍵的第一步,，否則，即使先進(jìn)的診斷設(shè)備,、技術(shù)完成的樣本鑒定結(jié)果對臨床不僅毫無意義,，還可能誤導(dǎo)臨床，帶來不良,、甚至嚴(yán)重后果,。

以下擬對臨床常見標(biāo)本規(guī)范采集、送檢進(jìn)行歸納,，并結(jié)合臨床工作指出常見誤區(qū),。

一、臨床常見微生物標(biāo)本規(guī)范采集與送檢

1,、下呼吸道標(biāo)本采集

痰培養(yǎng)因其采集方便,、花費(fèi)較少，為臨床醫(yī)師常規(guī)使用,。

但大量循證醫(yī)學(xué)研究以及指南均指出,，痰并非診斷細(xì)菌性肺炎的最佳標(biāo)本，尤其是醫(yī)院獲得性肺炎( HAP)。痰培養(yǎng)結(jié)果在診斷HAP中缺乏準(zhǔn)確性,。

氣管吸取物是另一類較為常見的標(biāo)本,，因在采樣時(shí)經(jīng)過正常菌群定植區(qū)域，因而結(jié)果解釋難度較大,。

美國感染性疾病協(xié)會(huì)( IDSA),、美國胸科醫(yī)師協(xié)會(huì)( ATS)、美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)更推薦采用血,、胸腔積液,、肺組織等無菌部位標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，或者支氣管肺泡灌洗液,、保護(hù)性毛刷獲取的標(biāo)本等低度污染標(biāo)本進(jìn)行定量或半定量培養(yǎng),，當(dāng)菌落計(jì)數(shù)高于閾值濃度時(shí)即認(rèn)為是HAP的病原菌，低于閾值濃度時(shí)則判斷為定植或污染,。

但有研究發(fā)現(xiàn),，氣管吸取物涂片結(jié)果通常包括侵入性定量培養(yǎng)檢出的微生物，因此,，該診斷方法具有很好的陰性預(yù)測值,，特別是近期（72 h內(nèi)）未更改抗生素治療方案的患者。不同標(biāo)本的診斷閾值及敏感性,、特異性見表1,。到目前為止，利用肺實(shí)質(zhì)定量培養(yǎng)進(jìn)行肺炎診斷的研究尚少,，我們引用的相應(yīng)靈敏度和特異度指標(biāo)來自一篇文獻(xiàn)，僅供參考,。

與HAP不同,，IDSA和ATS于2007年共同推出的《社區(qū)獲得性肺炎診療指南》指出：對于社區(qū)獲得性肺炎( CAP)門診患者，無需進(jìn)行微生物學(xué)檢查,，根據(jù)患者既往用藥史和基礎(chǔ)疾病史,，可直接給予大環(huán)內(nèi)酯類或喹諾酮類抗菌藥物治療即可，需要住院治療的CAP患者,，應(yīng)在充分評(píng)估患者基礎(chǔ)上選擇進(jìn)行痰培養(yǎng),、血培養(yǎng)、軍團(tuán)菌尿抗原檢測等,。

質(zhì)量好的痰標(biāo)本涂片結(jié)果對病原學(xué)診斷和抗生素選擇均有較好的提示作用,。Roson等進(jìn)行了一項(xiàng)針對非免疫受損的住院CAP患者的前瞻性研究顯示，診斷肺炎鏈球菌肺炎時(shí),，質(zhì)量好的痰標(biāo)本涂片鏡檢結(jié)果對診斷的敏感度和特異度分別為57%和97%,，對于流感嗜血桿菌肺炎，可高達(dá)82%和99%,。

2,、血培養(yǎng)

血培養(yǎng)是診斷細(xì)菌和真菌血癥的金標(biāo)準(zhǔn),。然而，采集過程中常出現(xiàn)的錯(cuò)誤,，嚴(yán)重影響著其結(jié)果,。

（1）采集血的最佳時(shí)間：目前，對采集血標(biāo)本的最佳時(shí)間存在著一定分歧,。Bennett和Beeson的研究顯示,，患者寒戰(zhàn)或體溫高峰來臨前1 h體內(nèi)細(xì)菌濃度最高，此時(shí)采血可 加血培養(yǎng)的陽性率,。2008年發(fā)表的另一項(xiàng)研究結(jié)果顯示,，血采集時(shí)間對血培養(yǎng)陽性率影響不大。

綜合文獻(xiàn)研究結(jié)果,，筆者認(rèn)為,，采集時(shí)間還應(yīng)結(jié)合臨床情況確定，應(yīng)用抗菌藥物之前采集標(biāo)本,，是包括血培養(yǎng)在內(nèi)的所有微生物學(xué)診斷的原則,。盡量在患者寒戰(zhàn)或體溫上升期采集，即使錯(cuò)過最佳采血時(shí)間,，隨時(shí)送檢血培養(yǎng)的臨床價(jià)值也遠(yuǎn)大于不送檢,。

（2）采血量：采血量是影響血培養(yǎng)陽性率最為重要的獨(dú)立因素。大部分成人血流感染患者血液內(nèi)微生物密度較低(≤1 CFU/ml),，增加血量可有效增加血培養(yǎng)的陽性率,。Lee等2007年發(fā)表的研究顯示，1套血培養(yǎng)( 20 ml)檢測敏感度為73.2%,，2套血培養(yǎng)(40 ml)敏感度為93. 9%,，3套血培養(yǎng)(60 ml)敏感度為96.9 %。目前的觀點(diǎn)認(rèn)為,，在不同部位采集2-3套血培養(yǎng)( 40-60 ml)為宜,；該方法還有助于后期鑒別分離到常見皮膚污染菌（如凝固酶陰性葡萄球菌）。

3,、其他標(biāo)本臨床檢測

（1）泌尿系感染：對留置尿管的患者進(jìn)行尿液微生物學(xué)評(píng)價(jià)時(shí),，切忌從尿袋內(nèi)直接留取尿液，應(yīng)在采樣端口或在近尿道口尿管處消毒,、穿刺采集,，置于無菌杯或試管中送檢。因尿管在拔除過程中可發(fā)生污染,，不推薦對尿管尖端進(jìn)行培養(yǎng),。對于未留置尿管的患者，應(yīng)指導(dǎo)患者規(guī)范采集清潔中段尿：做好手衛(wèi)生，用肥皂和清水徹底清潔尿道口及外陰部,；不間斷排尿,，棄去前段尿，留取中段尿于無菌容器中,。如尿標(biāo)本不能在采集后30 min內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),，必須冷藏。

冷藏的尿標(biāo)本應(yīng)在24 h內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),。對懷疑感染者,，還應(yīng)同時(shí)送檢尿常規(guī)，以對尿培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行合理解釋,；參照美國CDC醫(yī)療相關(guān)性感染診斷標(biāo)準(zhǔn),，當(dāng)患者尿常規(guī)白細(xì)胞酯酶和／或亞硝酸鹽試紙陽性并具有泌尿系感染癥狀、體征時(shí),，尿培養(yǎng)的診斷閾值可從105 CFU/ml調(diào)整為103 CFU/ml,。

（2）顱內(nèi)感染：懷疑顱內(nèi)感染時(shí)，需采集腦脊液標(biāo)本進(jìn)行微生物學(xué)診斷,。須嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作降低污染率,；采集到的腦脊液若多于1管，應(yīng)送檢被血污染較少的腦脊液（如第2或第3管等）,；若僅收集到1管腦脊液,，首先送往微生物實(shí)驗(yàn)室，之后再做其他檢查,。進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)時(shí),，腦脊液應(yīng)常溫保存，立即送檢,，不需轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基,。如進(jìn)行病毒培養(yǎng)，則應(yīng)在4—8℃保存,，如要保存48 h或更長時(shí)間,，應(yīng)在- 70℃儲(chǔ)存,。腦脊液標(biāo)本還應(yīng)同時(shí)進(jìn)行離心,、涂片檢查。

（3）膿腫：對于閉合性膿腫,，應(yīng)在膿腫表面清創(chuàng)后,，用注射器抽取膿腫內(nèi)容物；或?qū)⒛撃[切開引流,，取膿腫壁的一部分進(jìn)行培養(yǎng),，在厭氧運(yùn)輸容器中轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)本或采樣后即刻接種。對開放性損傷和膿腫，應(yīng)盡量擦去表面覆蓋物和滲出液,，以拭子用力擦拭病變基底或邊緣,，表淺切口感染標(biāo)本不宜進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。傷口邊緣處活檢,、組織培養(yǎng)是診斷厭氧菌,、分枝桿菌和真菌的最佳方法。

二,、正確理解,、應(yīng)用微生物檢驗(yàn)樣本送檢率指標(biāo)要求

1、相關(guān)送檢要求

國家衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)（原“衛(wèi)生部”）于2011年以來,，先后頒布了《全國抗菌藥物臨床應(yīng)用專項(xiàng)整治活動(dòng)方案》,、《抗菌藥物臨床應(yīng)用管理辦法》 。要求二級(jí)以上醫(yī)院應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)際需要,，建立臨床微生物室,；開展微生物培養(yǎng)、分離,、鑒定和藥物敏感試驗(yàn)等工作,；接受限制使用級(jí)抗菌藥物治療的住院患者，抗菌藥物使用前微生物檢驗(yàn)樣本送檢率不低于50%等,。送檢的標(biāo)本必須是有檢出微生物種,、屬潛在可能的樣本。

2,、抗菌藥物使用前微生物檢驗(yàn)樣本送檢注意事項(xiàng)

（1）非規(guī)范采集的呼吸道標(biāo)本過多：前文已經(jīng)介紹了肺炎診斷的微生物證據(jù)以及采樣方法,；但國內(nèi)目前存在的問題是忽視無菌部位標(biāo)本的采集（如血培養(yǎng)、胸腔積液培養(yǎng)等）,，隨意送檢普通方法經(jīng)口腔留取的痰標(biāo)本,，這樣的標(biāo)本在全部樣本的構(gòu)成比在相當(dāng)數(shù)量的醫(yī)院甚至高達(dá)70% 。如此獲得的結(jié)果不僅不能區(qū)別細(xì)菌定植與感染,、標(biāo)本污染,，更會(huì)導(dǎo)致誤導(dǎo)治療、流行病學(xué)數(shù)據(jù)不可靠,，需要盡快糾正,、摒除。

（2）非特異性炎癥指標(biāo)檢測泛濫：一些醫(yī)院在測算抗菌藥物使用前微生物送檢率時(shí)把ESR,、C反應(yīng)蛋白( CRP),、抗鏈球菌溶血素O( ASO)抗原、布氏桿菌凝集試驗(yàn)( BST),、肥達(dá)反應(yīng),、外周血乳膠凝集試驗(yàn),、降鈣素原( PCT)、某些病原微生物血清學(xué)診斷標(biāo)志物如1,，3-β-D葡聚糖檢測(G試驗(yàn)),、半乳甘露聚糖抗原檢測（GM試驗(yàn)）等都納入統(tǒng)計(jì)范疇。這不僅誤解了政策要求,，更會(huì)導(dǎo)致診斷的不確定性以及大量資源浪費(fèi),。

PCT的臨床應(yīng)用價(jià)值目前還有比較大的爭議。與其相關(guān)的文獻(xiàn)大多集中在CAP,、菌血癥,、腹腔感染等方面，對其他部位細(xì)菌感染的輔助診斷價(jià)值仍需進(jìn)一步研究,。而且,，PCT需要?jiǎng)討B(tài)監(jiān)測，其動(dòng)態(tài)變化遠(yuǎn)比單次結(jié)果更重要,?？紤]到PCT檢測的局限性（敏感性和特異性仍需要大幅提高、檢測試劑的穩(wěn)定性亟需提高,、不能鑒定細(xì)菌種類及藥敏,、不能滿足后續(xù)的降階梯治療需要、其結(jié)果僅對個(gè)體有參考而對流行性病學(xué)數(shù)據(jù)無價(jià)值等）和價(jià)格因素,，還不宜將其作為發(fā)熱患者常規(guī)檢測項(xiàng)目,，更不能替代血培養(yǎng)等無菌部位標(biāo)本的細(xì)菌培養(yǎng)診斷方法。

另外,，考慮到對診斷為重癥膿毒癥的患者,，診斷后1 h內(nèi)給予適當(dāng)?shù)目咕幬镏委煂戎位颊呤侵匾瓌t和改善預(yù)后的關(guān)鍵。而此時(shí),，尚無法獲得PCT的檢測結(jié)果,，因此，臨床上還應(yīng)結(jié)合患者病情給予合理判斷并開始相應(yīng)治療,。

G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)對于免疫缺陷或免疫抑制治療（如實(shí)體器官及造血干細(xì)胞移植）等存在真菌感染高危因素患者的診斷以及為挽救這些患者生命而積極抗真菌治療的價(jià)值得到了公認(rèn),。但兩者干擾因素多，對不同類型真菌感染診斷價(jià)值差異大,，且需要重復(fù)檢測,，對不存在真菌感染風(fēng)險(xiǎn)患者的診斷價(jià)值存在爭議，方法的標(biāo)準(zhǔn)化以及試劑的穩(wěn)定性都需要規(guī)范,，且價(jià)格較貴,。因此,，兩者均不宜作為疑似真菌感染患者常規(guī)鑒別方法,，除非患者存在真菌感染風(fēng)險(xiǎn),。

在臨床標(biāo)本采集一診斷環(huán)節(jié)，標(biāo)本涂片染色被忽視是另一個(gè)亟待解決的問題,。美國CDC關(guān)于肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)中,，特別提到了痰涂片染色如發(fā)現(xiàn)吞噬細(xì)菌的白細(xì)胞占視野內(nèi)白細(xì)胞比例超過5%為診斷依據(jù)之一。雖然,，涂片,、染色結(jié)果只能獲得革蘭染色陰性或陽性、球菌,、桿菌,、球桿菌等結(jié)果，但這些信息對于指導(dǎo)醫(yī)生制定恰當(dāng)抗感染初始方案已經(jīng)足夠了,。

對于某些細(xì)菌含量比較低的標(biāo)本,，如腦脊液，為提高涂片檢出率,，還可以離心,、甩片、染色,。此外,，某些部位如宮頸等可以直接刮取標(biāo)本、涂片,、染色,。某些情況下，使用位相顯微鏡直接觀察染色濕片可以獲得意外收獲,，而且,，還能對細(xì)菌活力進(jìn)行判斷，如霍亂弧菌檢查,。

總之,，正確的微生物檢驗(yàn)樣本送檢不僅可以明確病原菌，還可獲得其藥敏結(jié)果,，以進(jìn)一步指導(dǎo)治療,，并為細(xì)菌流行病資料積累提供可靠保障。因此,，上述血清學(xué)標(biāo)志物送檢雖有一定的臨床價(jià)值,，但不能替代微生物樣本培養(yǎng)及藥敏檢測。

三,、臨床微生物鑒定新方法展望與模式探討

由于某些病原微生物在臨床上很難培養(yǎng),、分離，新病原菌不斷出現(xiàn),，臨床上迫切需要不同于經(jīng)典的微生物培養(yǎng),、鑒定方法,。近年來，質(zhì)譜法( MS)的快速發(fā)展為上述問題提供了可靠解決方案,，如基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜( MALDI-TOF-MS)和PCR結(jié)合電噴霧離子化質(zhì)譜(PCR/ESI-MS),。

MALDI-TOF-MS是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，是細(xì)菌,、真菌分類和鑒定的快速,、可靠方法，可廣泛應(yīng)用于臨床診斷,。該方法可以極好地替代經(jīng)典的微生物鑒定和分類技術(shù),，僅需要極少的樣品和費(fèi)用；未來將成為醫(yī)學(xué)微生物菌種鑒定的標(biāo)準(zhǔn),。PCR/ESI-MS是另一種可以準(zhǔn)確診斷細(xì)菌,、真菌、病毒,、分枝桿菌以及細(xì)菌特殊耐藥基因,、病毒突變株等的新型病原鑒定方法。與MALDI-TOF-MS 一樣,，也可以用于醫(yī)院感染流行病學(xué)調(diào)查以及感染控制,。

肽核酸熒光原位雜交( PNA-FISH)、靶向?qū)崟r(shí)PCR,，如GeneXpert等方法由于其特異性高且價(jià)格較低,，其在微生物鑒定方面的價(jià)值已經(jīng)得到廣泛關(guān)注。目前,，這些新技術(shù)已經(jīng)在國內(nèi)開始應(yīng)用,，如GeneXpert對于艱難梭菌的診斷等。

不難看出,，上述病原鑒定方法無論是硬件需要還是技術(shù)難度,，都不適宜在二級(jí)、甚至某些三級(jí)醫(yī)院開展,。因此,，目前國內(nèi)迫切需要借鑒國外微生物鑒定模式，盡快建立微生物診斷醫(yī)師技術(shù)系列,，形成區(qū)域化病原診斷中心,，成立獨(dú)立的商業(yè)化病原診斷中心等。

這樣,，不僅可以最大限度符合衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)要求,，還可保證病原鑒定的準(zhǔn)確性、可靠性,，科學(xué)地指導(dǎo)臨床抗菌藥物的應(yīng)用與管理水平,。二級(jí)醫(yī)院宜保留對臨床標(biāo)本的初步處理和常見標(biāo)本的涂片及相應(yīng)鑒別能力,，從而既符合規(guī)范常見標(biāo)本的初步鑒定要求，快速指導(dǎo)臨床經(jīng)驗(yàn)用藥,，更可避免大量重復(fù)性建設(shè)及醫(yī)療資源的浪費(fèi)。