注：圖中橫坐標表示不同數(shù)量的OTU組合,，縱坐標表示該數(shù)量OTU組合下分類的錯誤率,。OTU組合數(shù)越少，且錯誤率越低,，則該OTU組合被認為是能夠區(qū)分組間差異的最少的OTU組合,。

3. ROC曲線

• 接收者操作特征曲線（Receiveroperating characteristic curve，ROC 曲線）也是一種有效的有監(jiān)督學習方法,。ROC分析屬于二元分類算法,，用來處理只有兩種分類的問題，可以用于選擇最佳的判別模型,選擇最佳的診斷界限值。  

• 可依據(jù)專業(yè)知識,，對疾病組和參照組測定結果進行分析,，確定測定值的上下限、組距以及截斷點(cut-offpoint),，按選擇的組距間隔列出累積頻數(shù)分布表,，分別計算出所有截斷點的敏感性(Sensetivity)、特異性和假陽性率(1-特異性:Specificity),。以敏感性為縱坐標代表真陽性率,，(1-特異性)為橫坐標代表假陽性率，作圖繪成ROC曲線,。ROC曲線越靠近左上角,，診斷的準確性就越高。亦可通過分別計算各個試驗的ROC曲線下的面積(AUC)進行比較,，哪一種試驗的AUC最大,，則哪一種試驗的診斷價值最佳。

注：圖中橫坐標為假陽性率false positive rate（FPR）：Specificity,，縱坐標為真陽性率true positive rate（TPR）：Sensetivity,。最靠近左上角的ROC曲線的點是錯誤最少的最好閾值，其假陽性和假陰性的總數(shù)最少,。ROC曲線下的面積值在1.0和0.5之間,。在AUC>0.5的情況下，AUC越接近于1,，說明診斷效果越好,。AUC在 0.5~0.7時有較低準確性，AUC在0.7~0.9時有一定準確性,，AUC在0.9以上時有較高準確性,。AUC=0.5時，說明診斷方法完全不起作用,，無診斷價值,。AUC<0.5不符合真實情況，在實際中極少出現(xiàn),。

4. Wilcoxon秩和檢驗分析

Wilcoxonrank-sum test,，也叫曼-惠特尼U檢驗（Mann–WhitneyU test），是兩組獨立樣本非參數(shù)檢驗的一種方法,。其原假設為兩組獨立樣本來自的兩總體分布無顯著差異,，通過對兩組樣本平均秩的研究來實現(xiàn)判斷兩總體的分布是否存在差異，該分析可以對兩組樣品的物種進行顯著性差異分析,，并對p值計算假發(fā)現(xiàn)率（FDR）q值,。

注：mean分別為兩組樣品物種的平均相對豐度,，sd分別是兩組樣本物種相對豐度的標準差。P值為對兩組檢驗原假設為真的概率值,，p<0.05表示存在差異,，p<0.01表示差異顯著，q值為假發(fā)現(xiàn)率,。

5.  差異菌群Heatmap分析

• 以10倍交叉驗證（10-foldcross-validation）估計泛化誤差（Generalizationerror）的大小,，其余參數(shù)使用默認設置。建模結果同時包含“基線”誤差（Baselineerror）的期望值,，即數(shù)據(jù)集中屬于最優(yōu)勢分類的樣本全部被錯誤分類的概率,。每個OTU根據(jù)其被移除后模型預報錯誤率增加的大小確定其重要度數(shù)值，重要度越高,，該OTU對模型預報準確率的貢獻越大,。  

• 根據(jù)挑選出來的差異OTU，根據(jù)其在每個樣品中的豐度信息,，對物種進行聚類,，繪制成熱圖，便于觀察哪些物種在哪些樣品中聚集較多或含量較低,。

注：圖中越接近藍色表示物種豐度越低,，越接近橙紅色表示豐度越高。左邊的聚類樹是根據(jù)各物種間的spearman相關性距離進行聚類,；上邊的聚類樹是采用樣本間距離算法中最常用的Bray-Curtis算法進行聚類,。

6. 兩組樣本W(wǎng)elch's t-test分析

兩組不同方差的樣本可使用Welch’st-test進行差異比較分析，通過此分析可獲得在兩組中有顯著性差異的物種[或差異基因豐度—適用于元（宏）基因組],。

注：上圖所示為不同基因豐度（或物種）在兩組樣品中的豐度比例,，中間所示為95%置信度區(qū)間內,，物種豐度的差異比例,，最右邊的值為p值，p值＜0.05,，表示差異顯著,。

7. Shannon多樣性指數(shù)比較盒狀圖

將不同分類或環(huán)境的多組樣本的Shannon多樣性指數(shù)進行四分位計算，比較不同樣本組的組間Shannon指數(shù)差異,。同時進行非參數(shù)Mann-Whitney判斷樣本組間的顯著性差異,。

注：橫坐標表示樣本分組，縱坐標表示相對應的Alpha多樣性指數(shù)值,；圖形可以顯示5個統(tǒng)計量（最小值,，第一個四分位，中位數(shù),，第三個中位數(shù)和最大值,，及由下到上5條線）,。p＜0.05，表示差異顯著,；P<0.01,，表示差異極顯著。

8. 基于距離的箱式圖

• 將不同分類或環(huán)境的多組樣本的距離進行四分位計算,，比較不同樣本組的組內和組間的距離分布差異,。同時進行multipleStudent’s two-sample t-tests判斷樣本組間差異的顯著性。  

• 箱式圖的作用：識別數(shù)據(jù)異常值,；粗略估計和判斷數(shù)據(jù)特征,；比較幾批數(shù)據(jù)的形狀，同一數(shù)軸上,，幾批數(shù)據(jù)的箱形圖并行排列,，幾批數(shù)據(jù)的中位數(shù)、尾長,、異常值,、分布區(qū)間等形狀信息一目了然。 

• 箱線圖（Boxplot）也稱箱須圖（Box-whiskerPlot）,，是利用數(shù)據(jù)中的五個統(tǒng)計量：最小值,、第一四分位數(shù)、中位數(shù),、第三四分位數(shù)與最大值來描述數(shù)據(jù)的一種方法,，它也可以粗略地看出數(shù)據(jù)是否具有對稱性，分布的分散程度等信息,，特別可以用于對幾組樣本的比較,。簡單箱線圖由五部分組成，分別是最小值,、中位數(shù),、最大值和兩個四分位數(shù)。

注：第一四分位數(shù) (Q1),，又稱“下四分位數(shù)”,，等于該樣本中所有數(shù)值由小到大排列后第25%的數(shù)字。第二四分位數(shù) (Q2),，又稱“中位數(shù)”,，等于該樣本中所有數(shù)值由小到大排列后第50%的數(shù)字。 第三四分位數(shù) (Q3),，又稱“上四分位數(shù)”,，等于該樣本中所有數(shù)值由小到大排列后第75%的數(shù)字。

9.  LEfSe分析

• LEfSe是一種用于發(fā)現(xiàn)高維生物標識和揭示基因組特征的軟件,。包括基因,，代謝和分類,，用于區(qū)別兩個或兩個以上生物條件（或者是類群）。該算法強調的是統(tǒng)計意義和生物相關性,。讓研究人員能夠識別不同豐度的特征以及相關聯(lián)的類別,。

• LEfSe通過生物學統(tǒng)計差異使其具有強大的識別功能。然后,，它執(zhí)行額外的測試,，以評估這些差異是否符合預期的生物學行為。

• 具體來說,，首先使用non-parametric factorial Kruskal-Wallis (KW) sum-rank test（非參數(shù)因子克魯斯卡爾—沃利斯和秩驗檢）檢測具有顯著豐度差異特征,，并找到與豐度有顯著性差異的類群。最后,，LEfSe采用線性判別分析（LDA）來估算每個組分（物種）豐度對差異效果影響的大小,。

說明：左邊的圖為統(tǒng)計兩個組別當中有顯著作用的微生物類群通過LDA分析（線性回歸分析）后獲得的LDA分值。右邊的圖為聚類樹,，節(jié)點大小表示豐度,，默認從門到屬依次向外排列。紅色區(qū)域和綠色區(qū)域表示不同分組,，樹枝中紅色節(jié)點表示在紅色組別中起到重要作用的微生物類群,，綠色節(jié)點表示在綠色組別中起到重要作用的微生物類群，黃色節(jié)點表示的是在兩組中均沒有起到重要作用的微生物類群,。圖中英文字母表示的物種名稱在右側圖例中進行展示,。

10. ANOSIM相似性分析

• 相似性分析(ANOSIM)是一種非參數(shù)檢驗，用來檢驗組間（兩組或多組）的差異是否顯著大于組內差異,，從而判斷分組是否有意義,。首先利用Bray-Curtis算法計算兩兩樣品間的距離，然后將所有距離從小到大進行排序,，按以下公式計算R值,，之后將樣品進行置換，重新計算R*值,，R*大于R的概率即為P值,。

Table.   Anosim analysis

注：理論上，R值范圍為-1到+1,，實際中R值一般從0到1，R值接近1表示組間差異越大于組內差異,，R值接近0則表示組間和組內沒有明顯差異,。P值則反映了分析結果的統(tǒng)計學顯著性，P值越小,，表明各樣本分組之間的差異顯著性越高,，P< 0.05表示統(tǒng)計具有顯著性,；Number of permutation表示置換次數(shù)。

11. Adonis多因素方差分析

Adonis又稱置換多因素方差分析（permutationalMANOSVA）或非參數(shù)多因素方差分析（nonparametricMANOVA）,。它利用半度量(如Bray-Curtis)或度量距離矩陣(如Euclidean)對總方差進行分解,，分析不同分組因素對樣品差異的解釋度，并使用置換檢驗對劃分的統(tǒng)計學意義進行顯著性分析,。

Table  permutational MANOVA analysis

注：

Group：表示分組,；

Df：表示自由度；

SumsOfSqs：總方差,，又稱離差平方和,；

MeanSqs：平均方差，即SumsOfSqs/Df,；

F.Model：F檢驗值,；

R2：表示不同分組對樣品差異的解釋度，即分組方差與總方差的比值,，即分組所能解釋的原始數(shù)據(jù)中差異的比例,，R2越大表示分組對差異的解釋度越高；

Pr(>F)：通過置換檢驗獲得的P值,，P值越小,，表明組間差異顯著性越強。