如果 marker 正常,，其他位置沒有條帶,，最可能是一抗加成其他抗體，或者二抗種屬加錯了,，比如兔的加成鼠的,。

a. 目的蛋白完全無信號，但同時做的內(nèi)參是正常的,，那么大部分情況是一抗抗體失效或用錯二抗,。

b. 目的蛋白和內(nèi)參均無信號，則考慮是否發(fā)光液失效,。如果膜上沒有 marker 則為轉(zhuǎn)膜失敗,。

c. 如果中間出現(xiàn)了細(xì)微條帶,，可能是蛋白上樣量太少,，或一抗?jié)舛冗^低。

上圖展示一點(diǎn)信號都沒有,，大部分情況是因為抗體加錯了,。如果中間出現(xiàn)細(xì)微的條帶，可能是蛋白上樣量太少,，一抗?jié)舛冗^低,，ECL 發(fā)光液失效。

封閉不充分，一抗?jié)舛冗^高,，洗膜時間次數(shù)不夠,。

降低一抗?jié)舛龋黾酉茨r間和次數(shù),。

a.一抗/二抗?jié)舛扰浔炔缓线m：雜帶多,，大概率是抗體特異性不好，也有可能抗體濃度太高,，可嘗試降低一抗?jié)舛冗M(jìn)行實(shí)驗,。

b.封閉液問題：配制封閉液所用的脫脂奶粉應(yīng)選用無防腐劑實(shí)驗專用脫脂奶粉。

c.洗膜不充分：洗膜按規(guī)定來 5min*5 次或 10min*3 次,。

高背景是 WB 實(shí)驗中最常見的問題,，目的條帶單一清晰，但其他地方又彌漫性較均一的背景（比較連續(xù)的）,。雜帶多大概率是抗體特異性不好,，也有可能抗體濃度太高，可嘗試降低一抗?jié)舛冗M(jìn)行實(shí)驗,。

一抗非特異性與蛋白結(jié)合,。

更換一抗。

此種情況絕大多數(shù)是因為一抗不好,，你無法判斷哪一條是目的條帶,。如果實(shí)在沒有更好的抗體，建議采用陰性對照和陽性對照來確定上述哪個條帶是目的條帶,。當(dāng)然也有一種很小幾率的可能是一抗?jié)舛忍咭鸬姆翘禺愋越Y(jié)合,。

a.電轉(zhuǎn)中膜與膠之間存在氣泡。

b.可能是轉(zhuǎn)膜過程燒膜了,，特別是半干轉(zhuǎn)操作不當(dāng)導(dǎo)致燒膜,。

c.轉(zhuǎn)膜時溫度過高產(chǎn)生氣泡。

d.印跡膜活化不佳,。

a.注意排清氣泡,。

b.優(yōu)化實(shí)驗條件或使用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。

c.把整個轉(zhuǎn)膜裝置放于 -20 度冰箱中電轉(zhuǎn),。

d.確保印跡膜完全活化,。

我們常常將電轉(zhuǎn)液倒入一個盤子里，倒入的液體不宜太多或太少,，建議高度與放上第一層濾紙齊平,，然后往濾紙上澆點(diǎn)轉(zhuǎn)膜液，往膠上面澆點(diǎn)電轉(zhuǎn)液,，用兩只手的拇指和食指輕輕夾住 NC 膜的兩側(cè)中間,，使膜成 U 型,，然后將 U 型底部接觸膠的中間，慢慢往兩邊放下膜,，這樣一般氣泡很少,。然后上層濾紙同樣用 U 型的放置方法，用玻璃棒稍微貼實(shí)下,，最后蓋上海綿,。

a.一般出現(xiàn)這種情況可能是封閉液溶解不完全或封閉液存放時間太久（長菌）。

b.膜上其他部位與一抗或二抗非特異性結(jié)合,。

a.過濾封閉液或選用其他類型封閉液,。

b.與其他品牌已驗證過好用的抗體處理相同樣本，作比較,，看是否還有斑點(diǎn),。

牛奶溶解后，最好靜止一下,，然后輕輕吸取上層牛奶進(jìn)行封閉,，封閉結(jié)束后一定要洗 3 遍之后再加一抗。

一抗?jié)舛忍吆蜁r間太長,。

根據(jù)情況調(diào)整一抗?jié)舛?，時間也可縮短。

這種情況一般出現(xiàn)在大分子量抗體實(shí)驗中,，是因為一抗?jié)舛忍?，作用時間太長引起的。另外洗一抗和洗二抗千萬不要偷工減漏,，建議 5min*5 次,，不要擔(dān)心洗這么多次把抗體和蛋白洗掉了，真正的抗原抗體相結(jié)合通過這種方式是洗不掉的,。

膜可能在孵育或洗滌過程中干過,。

每一步的操作過程中，注意不要讓膜干,。

封閉時洗一抗洗二抗,，以及發(fā)光時都應(yīng)時刻注意切記蛋白面風(fēng)干，一旦風(fēng)干很可能會導(dǎo)致這個結(jié)果,。

SDS-PAGE 膠中存在氣泡或某不溶性顆粒,。

配膠過程中，要注意不要使用無雜質(zhì)液體,。

很多實(shí)驗室中使用的不是最新設(shè)備,，比如配膠用的海綿墊，如果用了很多年,，會從下面往上面漏小氣泡,，當(dāng)氣泡足夠小并且膠快凝固的時候，走到中間的小氣泡就停留在膠內(nèi),，并會影響到后面的跑膠,。另外配膠用的水，SDS,，Tris 緩沖液要注意不要有雜質(zhì),。

a.配置膠凝固不均一。

b.轉(zhuǎn)膜問題：轉(zhuǎn)膜夾子不緊,，轉(zhuǎn)膜濾紙或海綿由于使用消耗,，濾紙及海綿變薄，海綿彈性不足,。

c.一抗孵育問題：抗體孵育不充分或抗體稀釋液放入過少,。

a.把膠配好，不合格的膠堅決不用,。

b.及時更換轉(zhuǎn)膜濾紙和海綿,。

c.增大抗體稀釋液用量、更換蹺蹺板類型的搖床將膜完全進(jìn)入抗體稀釋液中,。

出現(xiàn)啞鈴最大的可能是膠沒有配好,，膠凝固后不均一。如果你拔完梳子后出現(xiàn)上圖中下面部分的情況,，多半會出現(xiàn)啞鈴狀,。另外還有一種可能是樣品中含有太多雜質(zhì)，沒有離心下來,，然后雜質(zhì)沉積在孔的中間,，蛋白自然被推擠到兩邊。

電泳電流不均一,，玻璃板右下側(cè)有缺口,。

換用新的玻璃板，不使用兩邊的兩孔,。

一般我們使用的是 10 孔的膠,，如果你上樣剛好 10 個孔，那么最兩頭的兩個孔肯定會歪曲,。另外上樣最好在膠的中間,，這樣電場均一。

a.loading buffer 失效,，導(dǎo)致樣品變性失敗,。

b.上樣量過大或樣品雜質(zhì)多。

c.電壓太高,。

a.更換 loading buffer,。

b.超濾樣品或降低上樣量,。

c.降低電壓。

準(zhǔn)備樣本主要確認(rèn)上樣緩沖液是否為近期配置,，并且要妥善保存,，否則就會浪費(fèi)珍貴的實(shí)驗樣本。一般電泳過程中恒壓電泳,，濃縮膠 80V,，分離膠 120V，整個過程差不多需 2 個小時左右,。

轉(zhuǎn)膜問題,，對于分子量稍大的蛋白，轉(zhuǎn)膜時間過長,，轉(zhuǎn)膜裝置產(chǎn)熱過多,，無法維持轉(zhuǎn)膜時的低溫環(huán)境，造成條帶扭曲,。

建議在條件允許的情況下直接在 4℃ 中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,，將冰更換為冰水混合物，及時更換轉(zhuǎn)膜液并將轉(zhuǎn)膜液放入 4℃ 中提前預(yù)冷,。

對于大分子量的抗體,，跑膠前可以先把樣本煮一下，然后稍微離心一下,，同樣也可以改善這種情況,。

完整的 WB 實(shí)驗包括了很多步驟,，從蛋白提取到配膠,、上樣電泳，再到轉(zhuǎn)膜,、封閉,，最后孵育一抗二抗后才能去進(jìn)行檢測。時間跨度非常長,，而且這中間的每一步都包含了很多小細(xì)節(jié),，稍有不慎就會導(dǎo)致結(jié)果出錯，然后又得從頭來過,。

以下是大博士出品的 WB 實(shí)驗操作視頻,，手把手教大家如何對實(shí)驗步驟關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行精細(xì)化操作,。

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本實(shí)驗技術(shù)手冊為博士德資深技術(shù)人員根據(jù)多年實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗嘔心瀝血編寫,，圍繞以下目錄中八大核心技術(shù)內(nèi)容展開,，無論對于科研萌新或?qū)嶒炦_(dá)人都是滿滿的純干貨,。