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如需轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來源：解螺旋·醫(yī)生科研助手 ·導(dǎo)語· 在科研界,，細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)絕對(duì)占據(jù)了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域中的半壁江山。為了盡早發(fā)表高分文章,、走上人生巔峰,，奮斗在科研第一線的小伙伴們無不希望能早些拿下這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。小魚特地匯總一些久經(jīng)考驗(yàn)的可靠方法來檢測細(xì)胞增殖或細(xì)胞凋亡,。大家可以選擇最適合自己的檢測方式,，好結(jié)果自然就會(huì)水到渠成。 首先,，小魚將史上最全的細(xì)胞增殖檢測技術(shù)分享給大家   視頻鏈接： Brdu&EdU均是胸腺嘧啶的衍生物,，均可代替胸腺嘧啶在DNA合成期摻入細(xì)胞中,。 不同的是，Brdu檢測法可利用Brdu專一性抗體和其他細(xì)胞標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色,，可判斷增殖細(xì)胞的種類及增殖速度,，不僅適用于體外實(shí)驗(yàn)也能用于活體實(shí)驗(yàn),。這個(gè)方法最大的缺點(diǎn)需要變性DNA才能與抗體結(jié)合，破壞了DNA雙鏈結(jié)構(gòu),，導(dǎo)致染色彌散,、準(zhǔn)確性降低等問題,。 EdU檢測法則基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)檢測DNA復(fù)制活性，適用于細(xì)胞增殖,、細(xì)胞標(biāo)記示蹤等方面的研究,，尤其適合進(jìn)行siRNA,、miRNA、小分子化合物及其他藥物的篩選實(shí)驗(yàn),。EdU檢測染料只有BrdU抗體大小的1/500,在細(xì)胞內(nèi)很容易就擴(kuò)散,，無需DNA變性,。
 MTT檢測法反映細(xì)胞的能量代謝,，是檢測細(xì)胞增殖活力的一種簡便準(zhǔn)確方法。其原理是在活細(xì)胞生長和增殖過程中,，線粒體內(nèi)的脫氫酶可將黃色的MTT分解為藍(lán)紫色的水不溶性的甲瓚（Formazan）,，并沉積在細(xì)胞中，死細(xì)胞無此功能,。DMSO溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物,，用酶聯(lián)檢測儀在490nm波長處檢測其光密度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量,。 CCK8是MTT的升級(jí)版,，CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑中含有WST-8（MTT的類似物），在電子耦合試劑存在的情況下,，可被線粒體中的脫氫酶還原成橙黃色的甲瓚（Formazan）,，用酶聯(lián)檢測儀在450nm波長處檢測其光密度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量,。 細(xì)胞增殖越快,，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大,，則顏色越淺,。
CFSE是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料,，可逆的與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上,，是種良好的細(xì)胞標(biāo)記物,。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，CFSE標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中,，因此CFSE熒光強(qiáng)度呈對(duì)逐級(jí)遞減,，可利用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行分析。
Ki-67是目前較為肯定的核增殖標(biāo)志物，它只參與增殖細(xì)胞核反應(yīng),，其表達(dá)增強(qiáng)是細(xì)胞有絲分裂,、增殖活性增強(qiáng)的一個(gè)可靠標(biāo)記，研究表明Ki-67的表達(dá)能可靠而迅速的反應(yīng)惡性腫瘤的增值率,。
細(xì)胞凋亡視頻： 1,、通過光學(xué)顯微鏡或倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),。 1)未染色細(xì)胞 凋亡細(xì)胞的體積變小、變形,，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮,、變圓,、脫落。
2)染色細(xì)胞 常用吉姆薩染色,、瑞氏染色等,，凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化,，核膜裂解,、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。 2,、通過熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況,。該法中常用的DNA特異性染料有：Hoechst 33342, Hoechst 33258,DAPI。三種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū),。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光,。 細(xì)胞凋亡中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：I期的細(xì)胞核呈波紋狀或折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài),；II a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚,、邊緣化；II b期的細(xì)胞核裂解為碎塊,，產(chǎn)生凋亡小體,。
3、通過透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 凋亡細(xì)胞體積變小,，表面微絨毛消失,，細(xì)胞質(zhì)濃縮。 凋亡I期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞,，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu),；II a期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化,；細(xì)胞凋亡的晚期,，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體,。
凋亡細(xì)胞的細(xì)胞表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外,，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。
細(xì)胞凋亡中,，染色體DNA雙鏈或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3’-OH末端,，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素,、過氧化物酶,、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到3’-OH末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測。
因而，線粒體跨膜電位的存在,，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine123,、JC-1、TMRM等可接合到線粒體基質(zhì),，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低,。
Caspase家族在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能,。 Caspase-3正常以酶原（32kD）的形式存在于胞漿中，在凋亡早期階段被激活,，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17kD）和兩個(gè)小亞基（12kD）組成,，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,，但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞,，caspase-3的活性明顯下降。
綜上,，小魚總結(jié)了細(xì)胞凋亡分析總體原則：
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