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“基因測序技術的前世今生”

如今,，相信大部分人都已經(jīng)多少了解以及接觸過基因檢測,。基因檢測最常見的應用大多集中在疾病監(jiān)測和健康指導方面,，例如通過基因檢測了解自己是否有家族性遺傳病的致病突變,，又如提前預知某個疾病的患病風險，從而為自身的健康管理提供最好的依據(jù)等,。

基因檢測技術的發(fā)展，對于促進生命科學的進步，提高全人類的健康水平,，有著極其重要的意義,。那么在最早定義這一個個基因，并把它們和相關的序列聯(lián)系起來的時候,，生物家到底做出了哪些努力,？而基因所蘊含的遺傳密碼，又究竟是如何被檢測出來的呢,？

說到這些,，我們不得不提起一位在生物界人盡皆知的傳奇人物… …

1. 弗雷德里克·桑格

（Frederick Sanger）

1918年8月13日－2013年11月19日，是一位英國生物化學家,，發(fā)明了第一代基因測序技術——桑格法,，曾經(jīng)在1958年及1980年兩度獲得諾貝爾化學獎，是第四位兩度獲得諾貝爾獎,，以及唯一獲得兩次化學獎的人,。

——弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）

而剛剛過去的8月13日，正是桑格這位傳奇人物的誕辰日,。

1955年,，英國生物化學家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）測定了牛胰島素的一級結(jié)構，確定了胰島素兩條肽鏈分別含21個和30個氨基酸的排列順序和位置,。該項研究使他獨享1958年的諾貝爾化學獎,。

1975年時，桑格發(fā)明出一種稱為鏈終止法（chain termination method）的技術來測定DNA序列,，這種方法也稱作「雙脫氧終止法」（Dideoxy termination method）或是「桑格法」,，至今，這仍是基因測序界無可撼動的黃金標準,。

1977年,，他利用此項技術測定出Φ-X174型噬菌體的基因組序列，這也是人類歷史上首次完整的基因組測序工作,。

因此,，桑格憑借著雙脫氧終止法測序技術的應用，與發(fā)明化學降解測序法的沃特·吉爾伯特（Walter Gilbert）,，以及構建第一個重組DNA分子的保羅·伯格（Paul Berg）共同榮獲了1980年諾貝爾化學獎,。

桑格法的原理為核酸模板在核酸聚合酶、引物,、四種單脫氧堿基存在條件下復制或轉(zhuǎn)錄時,，如果在四管反應系統(tǒng)中分別按比例引入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端,，該鏈就隨機停止延長,，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長。如此每管反應體系中便合成以共同引物為5’端，以雙脫氧堿基為3’端的一系列長度不等的核酸片段,。反應終止后,，分四個泳道進行電泳。以分離長短不一的核酸片段（長度相鄰者僅差一個堿基）,，根據(jù)片段3’端的雙脫氧堿基,，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。

2. 第一代測序技術時代

——Sanger鏈終止法

以 ABI（Applied Biosystems Inc.）公司[1]研發(fā)的ABI 377測序儀為代表,，20世紀 80年代末,，科學家們開始用熒光標記的測序技術取代同位素標記測序，四色熒光標記的應用使測序反應物的分離能在一個變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的泳道完成,，從而降低了泳道間遷移率差異對測序精度的影響,，這為一塊平板膠做96個樣品的高密度電泳的發(fā)展奠定了基礎。

為了獲得更高通量,，20世紀90年代,，科學家們開始使用毛細管列陣電泳取代聚丙烯酰胺凝膠平板電泳，使樣本分離可在一系列平行的毛細管內(nèi)進行,，可同時并行分析多個樣本,，進一步加快了DNA的測序速度。

這一過程,，使得測序技術從平板膠電泳測序（Gel Electrophoresis）到毛細管電泳測序（Capillary Electrophoresis）產(chǎn)生了質(zhì)的飛躍,。

圖1： ABI公司測序儀器的發(fā)展

3. 第二代測序技術時代

——高通量基因測序

2001年，隨著人類基因組計劃的完成,，人們進入了功能基因組時代,，深度測序和重復測序等大規(guī)模基因組測序日益增多,。第一代測序方法已經(jīng)不能滿足這些需求,，科學家們開始尋求新的測序方法。第二代測序技術,，即大規(guī)模平行測序技術應運而生,。這不僅將DNA測序費用降到了以前的百分之一，并且由于其高通量的特征,，使得對一個物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組測序變得方便易行,。讓基因組測序這項以前專屬于大型測序中心的“特權”能夠被眾多研究人員分享。在此過程中,，市場上涌現(xiàn)出了很多第二代測序儀產(chǎn)品,，例如羅氏公司的454、Life Technologies公司的SOLiD, PGM,、 Illumina公司HiSeq等測序儀,。其中,，屬Illumina公司的二代測序儀最具代表性，首屈一指的高通量技術使該公司占據(jù)最大市場份額,。

圖2：Illumina測序儀的發(fā)展史

4. 測序價格發(fā)展趨勢

據(jù)NIH數(shù)據(jù)統(tǒng)計,，2001年，全基因組測序需要耗資高達一億美元,；2011年，第二代測序技術成功推出后全基因組測序價格已下降至1萬美元,；2014年,，隨著Illumina X Ten的成功上市又再次將價格大幅度縮減至1千美元，而2017年1月,，在JP摩根健康大會上,，IIIumina NovaSeq 6000的上市更是在如今百舸爭流的基因測序市場脫穎而出，Illumina 的總裁這樣說道：“推出 NovaSeq 是 Illumina 創(chuàng)新歷史上的一個最重要的拐點,。就如同我們在2014年首次發(fā)布 HiSeq X 時,，該儀器通過 HiSeq? 架構將每個基因組的成本降至1000美元一樣，我們相信未來從今日發(fā)布的 NovaSeq 架構發(fā)展而來的系統(tǒng)總有一天會將單個基因組的價格降至100美元,?！?/p>

圖3：NIH數(shù)據(jù)，2001年-2015年全基因組測序價格變化

來源：明碼生物科技