PCR技術(shù)自問世以來,，在遺傳病、病原體,、癌基因等分子診斷領(lǐng)域和法醫(yī)鑒定等方面發(fā)揮了巨大作用。第一代 PCR在進行擴增后通過凝膠電泳進行定性分析,。

隨著生物分子熒光技術(shù)的發(fā)展,，1992年實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 應(yīng)運而生,。qPCR是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)熒光強度來測定每次聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法,。由于在PCR擴增的指數(shù)時期,，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以Ct值也就成為定量的依據(jù),?；跓晒馓结樆蛉玖系牡诙?PCR 技術(shù)隨后逐漸發(fā)展為檢測核酸目標片段的主流分子診斷學(xué)技術(shù)。

在實時定量 PCR（qPCR） 過程中,，熒光信號隨著擴增產(chǎn)物的積累而增強,。qPCR 能夠?qū)崟r獲得模板擴增的熒光值，然后根據(jù)DNA 模板在指數(shù)增長時期的 Ct 值與標準 DNA 的Ct值比較來計算初始模板的濃度,。但是這種方法由于是大體積反應(yīng)系統(tǒng),，非特異性的擴增增加了假陽性結(jié)果和背景信號，因此,，最終無法獲得絕對定量的結(jié)果,。

隨著MEMS工藝的不斷成熟和微流控技術(shù)的不斷發(fā)展，新一代PCR技術(shù),，數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR) 也隨之出現(xiàn),。digital PCR是一種新的絕對定量PCR，主要是對PCR反應(yīng)物進行有限稀釋,，隨后在不同的反應(yīng)腔室里進行PCR擴增,，最后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度的技術(shù)。

圖1. PCR技術(shù)的發(fā)展歷程

20 世紀末,，Vogelstein 等提出數(shù)字PCR( digitalPCR,，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份,，分配到不同的反應(yīng)單元,，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應(yīng)單元中分別對目標分子進行PCR 擴增,，擴增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進行統(tǒng)計學(xué)分析,。

dPCR是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。

圖2. dPCR基本原理

dPCR一般包括兩部分內(nèi)容,，即PCR擴增和熒光定量分析,。

在PCR 擴增階段，與傳統(tǒng)技術(shù)不同,，dPCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平,，并平均分配到幾萬個反應(yīng)腔室里反應(yīng)。這樣子相當于變相的對靶基因進行富集,。與此同時,，由于對原樣品的大幅度的稀釋,，使得PCR抑制劑濃度顯著降低，這樣dPCR對初始PCR反應(yīng)物里抑制劑的要求顯著低于qPCR,。

不同于 qPCR對每個循環(huán)進行實時熒光測定的方法,，dPCR 技術(shù)是在擴增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進行采集，最后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度,。

圖3. dPCR可以實現(xiàn)痕量核酸的高靈敏檢測

相對于熒光定量PCR（qPCR）而言,，dPCR具備以下優(yōu)勢：

1、靈敏度可達單個核酸分子：檢測限低至0.001%,，原因在于dPCR可以實現(xiàn)靶標DNA/RNA的富集,；

2、無需標準品（標準曲線）,，即可對靶分子起始量進行絕對定量,；

3、特別適合基質(zhì)復(fù)雜樣品的檢測：終點PCR檢測,，不依賴Ct值,，不依賴擴增效率，能克服PCR抑制劑的影響,，適合動血樣,、FFPE組織、糞便,、尿液,、痰液、水樣,、土壤,、植物等復(fù)雜樣品中DNA的絕對定量；

4,、能夠有效區(qū)分濃度差異（變化）微小的樣品：更好的準確度,、精密度和重復(fù)性，可以用于精確測定靶基因的相對表達,，基因拷貝數(shù)變異分析等,。

圖4. qPCR和dPCR的對比

圖5. dPCR的多指標并行檢測的實現(xiàn)方式

如同qPCR一樣，dPCR中實現(xiàn)多指標的并行檢測能顯著降低檢測成本,，獲取更豐富的檢測信息,。

不同于qPCR中的多腔室擴增與多熒光通道結(jié)合的并行PCR方式，在dPCR里,，一個微反應(yīng)腔室里一般只含一種靶基因,。

所以dPCR的多指標檢測主要通過以下兩種方式實現(xiàn)：

1. 多個熒光通道。使用多種熒光染料來標記不同的要檢測的靶基因,。

2. 單波長多強度,。使用一種熒光染料,，但是擴增結(jié)束時不同的靶基因?qū)?yīng)的染料的熒光強度不一樣。

微流控芯片技術(shù)能夠快速并準確地將樣品流體分成若干個獨立的單元, 從而進行多步平行反應(yīng),，并且具有成本低、體積小和高通量等特點,，是理想的數(shù)字PCR平臺,。按照其獨立的單元的實現(xiàn)方式來細分，dPCR又分為基于液滴微流控（droplet microfluidics）的微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）和基于芯片式微流控的微陣列芯片式PCR,。

5.1微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）

微滴數(shù)字PCR主要是將兩種互不相溶的液體,，以其中一種作為連續(xù)相（油），另一種作為分散相（水）,，在水/油兩相表面張力和剪切共同作用下分散相以微小體積單元的形式存在于連續(xù)中,，從而成液滴。這種液滴式的反應(yīng)腔室具有體積小,、樣品間無擴散等優(yōu)勢,。

在ddPCR中，利用微滴發(fā)生器可以一次生成數(shù)萬乃至百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴,，作為數(shù)字 PCR 的樣品分散載體,。這里，液滴中包裹了單拷貝DNA模板和PCR反應(yīng)液,，然后將液滴收集在PCR反應(yīng)管中進行擴增,。?PCR反應(yīng)結(jié)束后檢測每個微滴的熒光信號。

目前Bio-Rad公司的QX100系統(tǒng),、QX200系統(tǒng)均為采用液滴技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng),。

圖6. Bio-Rad的droplet digital PCR系統(tǒng)

5.2 微陣列芯片式PCR

微陣列芯片式PCR主要通過芯片設(shè)計將納升液體封閉在高通量的微池或微量通道中進行后續(xù)的PCR擴增及擴增后結(jié)果的熒光顯微鏡直接判讀。

按芯片設(shè)計方式,，微陣列芯片式PCR又可以分為陣列微池式芯片,、滑片式芯片和集成微泵閥芯片：

1.陣列微池式芯片上刻蝕有微池陣列，反應(yīng)液由進樣孔直接導(dǎo)入個反應(yīng)微池,；

2.滑片式芯片是設(shè)計帶有微流體通道和反應(yīng)單元的玻璃芯片,，上下兩篇玻璃芯片間用油相密封，通過滑動芯片將樣品溶液從液體通道引入反應(yīng)單元,，同時生成成百上千個微反應(yīng)滴陣列,；

3.集成微泵閥式芯片是通過多層軟刻蝕技術(shù)在聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片上加工交織的液體和氣體通道結(jié)構(gòu)，通過精確地控制微泵閥的開啟和關(guān)閉,，快速并準確地將流體分成若干個陣列的獨立單元,。

2010年，Life Technologies也推出了基于陣列微池式芯片的數(shù)字PCR產(chǎn)品線–OpenArray系統(tǒng),。它提供的TaqMan OpenArray 數(shù)字PCR試劑盒可在OpenArray平板上運行,。平板可在現(xiàn)有的OpenArray 實時定量PCR系統(tǒng)以及新上市的QuantStudio? 12K Flex儀器上運行,。OpenArray 實時定量PCR系統(tǒng)能夠同時運行3塊OpenArray平板。

圖7. TaqMan? OpenArray? Digital PCR系統(tǒng)

Fluidigm公司于2006年底推出了基于集成流體通路（IFC）芯片的Bio-Mark? 高通量基因剖析系統(tǒng),。

其創(chuàng)新在于集成液體通路技術(shù)：應(yīng)用集成電路制造工藝（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體,，經(jīng)過不同的控制閥門控制溶液在其中的活動來完成生物樣品的分液、混合,、PCR擴增,。

圖8. Bio -Mark? IFC芯片

來源：體外診斷網(wǎng)

作者：湯明輝  香港中文大學(xué)電子工程系微流控方向在讀博士。

2010-2014：南京大學(xué)光電信息工程系本科,；2014至今：香港中文大學(xué)電子工程系碩博,。

博士期間以離心微流控平臺為載體，研究基于微流控的全自動化體外診斷儀器設(shè)備,。研究重點在于基于微流控技術(shù)的全自動化的分子診斷系統(tǒng)和基于微流控技術(shù)的全自動化的藥敏試驗系統(tǒng),；當下也重點關(guān)注基于微流控的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，基于CTC的液體活檢技術(shù)和digital PCR技術(shù),；研究核心在于微流控芯片的設(shè)計與整個系統(tǒng)的搭建,。

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