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肺癌相關(guān)的細(xì)胞外囊泡（EV）中的lncRNA是臨床上有價(jià)值的生物標(biāo)志物，可用于液體活檢早期診斷,。然而,，外周血中極微量的EV-lncRNA是多靶點(diǎn)檢測(cè)的主要挑戰(zhàn)。來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所毛紅菊課題組以及同濟(jì)大學(xué)附屬上海肺科醫(yī)院陳昶課題組的研究人員開(kāi)發(fā)了一種新的多色熒光數(shù)字PCR EV-lncRNA（miDER）分析芯片,，能夠快速準(zhǔn)確地分析外周血中微量的肺癌EV-lncRNA生物標(biāo)記物,。該研究發(fā)表于Biosensors and Bioelectronics雜志上（影響因子9.518）。 肺癌是世界上發(fā)病率最高,、最常見(jiàn),、死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤。由于肺組織的復(fù)雜性,，早期肺癌沒(méi)有明顯的癥狀,，并且肺癌易于擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，通常在診斷時(shí)已經(jīng)是中期或晚期,。肺癌的早期檢測(cè)主要基于成像和腫瘤蛋白標(biāo)記物檢測(cè),。先進(jìn)的成像技術(shù)，如多層螺旋計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）和正電子發(fā)射斷層掃描（PET）可以檢測(cè)直徑約2-6毫米的腫瘤,。低劑量螺旋CT具有高靈敏度,，使患者避免了一些其他創(chuàng)傷性檢查。然而,，由于低劑量螺旋CT靈敏度高,、誤報(bào)率高，導(dǎo)致目前低劑量螺旋CT的過(guò)度診斷,、誤報(bào)和不必要的活檢。因此,，通過(guò)低劑量CT篩查后鑒別真陽(yáng)性和假陽(yáng)性是一個(gè)迫切的問(wèn)題,。 肺組織活檢可提供高診斷準(zhǔn)確性。然而,，這種方法不方便且具有侵入性并且可能導(dǎo)致額外的并發(fā)癥,。因此，迫切需要非侵入性和高敏感度的診斷方法來(lái)改善早期診斷和結(jié)果,。體液如血液被認(rèn)為是疾病診斷的理想樣本,。先前的研究已經(jīng)表明，從血液中收集包括外泌體和微泡在內(nèi)的細(xì)胞外囊泡（EV）用于進(jìn)一步分析,，是腫瘤衍生物和生物標(biāo)記物的新來(lái)源,。 EV是由大多數(shù)細(xì)胞分泌的膜結(jié)構(gòu),、納米級(jí)的內(nèi)吞囊泡,。從腫瘤細(xì)胞分泌的EV與腫瘤發(fā)展、免疫逃逸和腫瘤微環(huán)境密切相關(guān),。EV含量豐富,、穩(wěn)定，并包含反映其起源細(xì)胞的獨(dú)特蛋白質(zhì)和核酸（例如DNA,、mRNA,、miRNA和lncRNA）成分,。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，來(lái)自外周血的長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸（lncRNA）是潛在的腫瘤生物標(biāo)志物,。LncRNA被定義為最小長(zhǎng)度為200個(gè)核苷酸并且無(wú)蛋白質(zhì)編碼能力的轉(zhuǎn)錄物,。LncRNA表達(dá)不僅可以區(qū)分正常人群和肺癌患者，還可以與肺癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān),。在之前的研究中,，研究團(tuán)隊(duì)曾篩選了早期肺癌組織中差異表達(dá)的lncRNA，并證明這些lncRNA可能是臨床上有用的早期診斷生物標(biāo)志物,。然而，由于難以從疑似患有肺癌的患者獲得組織樣品,，因此需要開(kāi)發(fā)循環(huán)EV-lncRNA作為生物標(biāo)志物,，將這種靈敏、準(zhǔn)確且成本較低的方法用于肺癌診斷,。 現(xiàn)有的lncRNA檢測(cè)方法包括定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）,、微陣列、二代測(cè)序和表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）,?；赟ERS的方法在早期檢測(cè)中受限于SERS底物缺乏光譜再現(xiàn)性?；诙鷾y(cè)序的分子探測(cè)方法依賴于復(fù)雜的文庫(kù)制備方案,，并且需要高測(cè)序深度以實(shí)現(xiàn)高靈敏度。使用微陣列和qPCR方法,，難以檢測(cè)低拷貝數(shù)的靶標(biāo),。據(jù)報(bào)道，EV中l(wèi)ncRNA的含量非常低,，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)胞中的mRNA水平,。因此,，需要一種更靈敏、準(zhǔn)確,、方便的定量方法來(lái)研究低豐度EV-lncRNA,。 數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（dPCR）是一種單分子檢測(cè)技術(shù)。該終點(diǎn)法不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線,，對(duì)低豐度EV-lncRNA靶標(biāo)定量能表現(xiàn)出高精度,，并且對(duì)殘留的PCR抑制劑具有抗性。然而,，現(xiàn)有的dPCR系統(tǒng)涉及用于液滴產(chǎn)生,、PCR循環(huán)和讀出的若干復(fù)雜儀器。此外,，商業(yè)液滴PCR系統(tǒng)的靈敏度和多路復(fù)用能力受每次運(yùn)行可產(chǎn)生和分析的液滴總數(shù)的限制,。因此，復(fù)雜的儀器,、長(zhǎng)時(shí)間的圖像采集,、低檢測(cè)通量和高成本限制了dPCR的廣泛實(shí)施。
為了解決這些局限性,，在本研究中,，研究人員開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單、靈敏,、準(zhǔn)確,、高通量、低成本的微流體平臺(tái),，命名為多色熒光數(shù)字PCR EV-lncRNA（multi-colour fluorescence digital PCR EV-lncRNA,，miDER）分析，該系統(tǒng)可以快速實(shí)現(xiàn)芯片分析EV-lncRNA表達(dá),。由于單一標(biāo)記物對(duì)腫瘤診斷的敏感性和特異性有限,，而多個(gè)標(biāo)記物的聯(lián)合檢測(cè)通常具有較高的敏感性和特異性，可進(jìn)一步提高腫瘤診斷的準(zhǔn)確性,。miDER系統(tǒng)采用多重PCR技術(shù)結(jié)合微流控芯片對(duì)序列進(jìn)行分區(qū)和擴(kuò)增,，可同時(shí)檢測(cè)低水平的多靶點(diǎn)EV-lncRNA，提高檢測(cè)通量,、減少樣品和試劑劑量,。 結(jié)果顯示，在miDER檢測(cè)中,，來(lái)自外周血的靶基因的檢測(cè)上限為10拷貝/μL,。在多重檢測(cè)中，肺癌患者（n = 32）和健康對(duì)照組（n = 30）中兩種肺癌相關(guān)lncRNA（SLC9A3-AS1和PCAT6）的表達(dá)水平在兩組之間存在顯著差異（P <0.001）,。使用受試者操作特征（ROC）曲線分析來(lái)評(píng)估這些lncRNA的識(shí)別能力,。在miDER檢測(cè)中兩種lncRNA的組合產(chǎn)生更高的曲線下面積（AUC）值0.811（95％CI =0.705-0.918）,。此外，為了確定miDER測(cè)定的絕對(duì)定量能力,，研究人員將這些結(jié)果與qPCR獲得的結(jié)果進(jìn)行比較,，證明miDER測(cè)定比qPCR更敏感?；趍iDER的多重檢測(cè)可為體液中極微量EV-lncRNA的多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)提供新的解決方案,，并證明EV-lncRNAs作為肺癌檢測(cè)生物標(biāo)志物的應(yīng)用。 參考文獻(xiàn)：Bai Y, Qu Y, Wu Z, Ren Y, Cheng Z, Lu Y, Hu J, Lou J, Zhao J, ChenC, Mao H. Absolute quantification and analysis of extracellular vesicle lncRNAs from the peripheral blood of patients with lung cancer based on multi-colour fluorescence chip-based digital PCR. Biosens Bioelectron. 2019 Jul17;142:111523. 【科研成長(zhǎng)加油站】 腫瘤公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)SEER挖掘分析專題會(huì)議（8/10-11 上海） R語(yǔ)言與多組學(xué)數(shù)據(jù)個(gè)性化分析（直播培訓(xùn)課 8/3,；8/10,；8/17；8/24） 中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的實(shí)用技術(shù)和策略（直播培訓(xùn)課 8/3,；8/10,；8/17；8/24,；8/31） “腸道菌與代謝”課題設(shè)計(jì)思路與研究方法專題學(xué)習(xí)班（8/3-4,；8/31-9/1 上海）
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