耳聾是人類最常見的致殘性疾病之一，據(jù)WHO2013年的數(shù)據(jù),，全世界范圍內(nèi)約有3.6億人遭受耳聾的困擾,。耳聾不但會造成嚴(yán)重的交流障礙，更為嚴(yán)重的是影響兒童的言語和認知功能發(fā)育,。耳聾可大致分為三種類型：傳導(dǎo)性耳聾,、感音神經(jīng)性耳聾和混合性耳聾。其中,，感音神經(jīng)性耳聾占耳聾的大部分,。感音神經(jīng)性耳聾是由于耳蝸毛細胞、聽神經(jīng),、聽傳導(dǎo)通路各級神經(jīng)元受損害所導(dǎo)致的聲音感受與神經(jīng)沖動傳遞障礙,，其常見的致聾因素有耳毒性藥物使用、感染,、噪聲暴露,、年齡及遺傳因素等。部分感音神經(jīng)性耳聾患者可以通過藥物治療,，但絕大部分患者只能依靠配戴助聽器和/或人工聽覺植入提高聽力,。然而,，無論是助聽器，還是人工聽覺植入,，都僅僅是一種替代治療,，其治療效果仍不盡如人意，功能上無法與正常聽力相比,。

        基因治療是指通過操作遺傳物質(zhì)來干預(yù)疾病的發(fā)生,、發(fā)展，通過替代和糾正異常的致病基因來達到治療疾病的目的,。近年來,，隨著遺傳基因與耳聾發(fā)病機制研究的不斷深入，各種耳聾動物模型的建立,，越來越多的學(xué)者試圖通過基因治療的方式來預(yù)防和治療感音神經(jīng)性耳聾,。內(nèi)耳膜迷路相對封閉、處于骨性迷路的包繞之中,，與周圍組織相對隔離,；注入耳蝸內(nèi)的載體可以通過流動的外淋巴液或內(nèi)淋巴液在耳蝸內(nèi)擴散。由于這些特殊的解剖和生理特點,，使耳蝸在基因治療方面擁有其它器官無法比擬的優(yōu)勢,，為內(nèi)耳基因治療提供了理想的環(huán)境。本文將結(jié)合最新的國內(nèi)外研究進展,，對感音神經(jīng)性耳聾的基因治療進展做一綜述。

        1 感音神經(jīng)性耳聾基因治療的主要策略

        1.1 聽神經(jīng)的保護與再生

        對于重度感音神經(jīng)性耳聾患者,，目前主要的治療方法是人工耳蝸植入,。然而人工耳蝸植入要求有一定數(shù)量的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞。術(shù)后效果取決于殘存螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的數(shù)量,。動物實驗結(jié)果表明神經(jīng)營養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）,、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（neurotrophin-3,NT-3）有助于耳聾后螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的存活。有學(xué)者使用新霉素致豚鼠耳聾后1周,，通過腺病毒和腺相關(guān)病毒向豚鼠耳蝸內(nèi)導(dǎo)入BDNF,，結(jié)果表明可有效保護螺旋神經(jīng)節(jié)細胞并且能夠促進其神經(jīng)纖維向基底膜方向生長。因此,，基因治療和人工耳蝸植入聯(lián)合應(yīng)用有望提高人工耳蝸植入的遠期療效,。

         1.2 毛細胞保護與再生

        毛細胞是產(chǎn)生聽覺沖動的感受器，人類的毛細胞一旦缺失,，不可再生,。毛細胞的保護對于防止耳聾具有重要意義。現(xiàn)實生活中,，大的環(huán)境噪聲,、耳毒性藥物（如氨基糖苷類抗生素和順鉑）的使用均可導(dǎo)致毛細胞損傷,。基因治療可以通過表達某些具有保護作用的基因或沉默耳毒性發(fā)生過程中的某些關(guān)鍵基因起到保護毛細胞和聽力的作用,。Kawamoto以腺病毒為載體,，通過在豚鼠耳蝸內(nèi)過表達銅/鋅超氧化物歧化酶（superoxide dismutase 1,SOD1），錳超氧化物歧化酶（SOD2）,，過氧化氫酶（catolase,CAT）成功地預(yù)防了卡那霉素導(dǎo)致的耳聾,。Cooper以腺相關(guān)病毒為載體通過表達X連鎖凋亡抑制蛋白（x-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP）來預(yù)防順鉑耳毒性。Mukherjea通過鼓室內(nèi)注射小干擾RNA來拮抗NADPH氧化酶3（NADPHoxidase 3,NOX3）來阻止注射順鉑后氧自由基的產(chǎn)生,，從而預(yù)防毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)的損傷,。

        一旦毛細胞發(fā)生死亡，治療的重點就從毛細胞的保護轉(zhuǎn)移到再生,。隨著毛細胞再生研究的深入,，已發(fā)現(xiàn)了多個潛在的基因治療靶點，其中最有代表性的是Atoh1基因,。Atoh1基因是毛細胞分化所必需的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,，已經(jīng)有多項動物研究證明在內(nèi)耳進行Atoh1基因的過表達，通過Corti器支持細胞的轉(zhuǎn)分化實現(xiàn)了耳蝸和前庭毛細胞再生,。

        1.3 遺傳性耳聾的基因治療

        與其他致病因素導(dǎo)致的耳聾不同,，遺傳性耳聾的基因治療不能通過毛細胞的再生來實現(xiàn)，而需要通過導(dǎo)入野生型的基因取代或補充致病基因的功能,。近幾年來遺傳性耳聾的基因治療研究取得了很大的突破,，已經(jīng)有多項研究通過基因治療的方式逆轉(zhuǎn)了遺傳性耳聾小鼠動物模型的聽力表型。包括GJB6,、VGLUT3,、TMC、KCNQ1在內(nèi)的基因敲除小鼠,，都通過向耳蝸內(nèi)導(dǎo)入相應(yīng)的野生型基因,，成功地保留了部分聽力。這一系列研究成果預(yù)示基因治療有望成為治療遺傳性耳聾的有效方法,。

        2 感音神經(jīng)性耳聾基因治療載體

        基因治療的開展首先需要有理想的基因治療載體,，目前常見的基因載體有病毒載體和非病毒載體兩大類。由于轉(zhuǎn)染效率較高,，病毒載體是應(yīng)用最為廣泛的載體,。用作耳聾基因治療載體的病毒主要有腺病毒、腺相關(guān)病毒,、慢病毒,、單純皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等,。其中最為常用的是腺病毒和腺相關(guān)病毒,。

         2.1 腺病毒（adenovirus,AV）

        腺病毒具備①感染非分裂和分裂細胞,；②可高效、迅速地傳遞和表達基因,；③易于制備,；④基因組不整和進入宿主染色體而相對安全等優(yōu)點。被廣泛應(yīng)用于內(nèi)耳基因治療的研究中,。Raphael通過圓窗膜注射的方法,，將載有大腸桿菌β-半乳糖（LacZ）的腺病毒導(dǎo)入鼓階內(nèi)，結(jié)果顯示耳蝸毛細胞,、支持細胞,、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞、血管紋,、前庭膜,、螺旋韌帶均被轉(zhuǎn)染，其中以螺旋神經(jīng)節(jié)細胞轉(zhuǎn)染效率最高,。其他研究也證實了腺病毒經(jīng)鼓階鉆孔途徑可以成功轉(zhuǎn)染包括毛細胞,、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞以及支持細胞在內(nèi)的多種內(nèi)耳細胞。但是腺病毒有一定的毒性,，免疫源性較強,，并且只能實現(xiàn)目的基因的短暫表達（1個月），因此應(yīng)用受到了很大限制,。

         2.2 腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus,AAV）

         AAV無致病性和毒性,，因被轉(zhuǎn)染的基因整合入宿主的基因組內(nèi)，所以能夠長時間表達,。動物實驗證明,，AAV既能夠感染毛細胞，又能夠感染支持細胞,。不同血清型的AAV對耳蝸內(nèi)細胞的轉(zhuǎn)染效率也不相同，Askew通過小鼠耳蝸組織體外培養(yǎng)實驗證明,，在AAV1,、2、6,、8,、9血清型中，AAV1/2對毛細胞的轉(zhuǎn)染效率最高,，體內(nèi)實驗也證實了這一點,。但是，腺相關(guān)病毒DNA裝載量有限,，制備比較困難,，并且會引起宿主的免疫反應(yīng),，限制了其應(yīng)用。

        2.3 非病毒載體

       與病毒載體相比較,，非病毒載體具有諸多的優(yōu)勢,，例如制備簡單，毒性低,，不會誘發(fā)宿主的免疫反應(yīng),，對攜帶基因容量沒有限制，可以通過生物學(xué)改造來獲得多種生物學(xué)特性等,。非病毒基因載體主要有陽離子脂質(zhì)體,、陽離子聚合物、納米材料,。近年來用于內(nèi)耳基因治療的非病毒載體主要有聚乙烯亞胺（polyethylene imine,PEI）,、聚酰胺-胺型樹狀物（PAMAM-D）、羥基磷灰石納米顆粒,、四氧化三鐵納米顆粒等,，但這些非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率相對較低。理想的基因治療載體應(yīng)該具備以下條件：①在體內(nèi)能夠?qū)NA準(zhǔn)確送入靶細胞和靶組織,；②能夠?qū)NA轉(zhuǎn)運進入細胞核并高效表達,；③轉(zhuǎn)染效率較高，

強度和時間可控,；④安全性高,；⑤易于大規(guī)模制備。現(xiàn)階段,，無論是病毒載體還是非病毒載體都還無法滿足上述條件,，感音神經(jīng)耳聾基因治療的開展，仍需要探索新型的基因載體,。

        3 感音神經(jīng)性耳聾基因治療載體導(dǎo)入途徑

        內(nèi)耳血迷路屏障的存在,、骨性結(jié)構(gòu)包裹以及淋巴液流動的特點使得內(nèi)耳適合于基因治療。同時,也使得如何安全,、高效地將目的基因轉(zhuǎn)入至耳蝸內(nèi)成為一個難題,。因此，探索一條安全有效的內(nèi)耳基因轉(zhuǎn)移方法是開展內(nèi)耳基因治療的重要前提之一,。目前在動物實驗研究中常用的基因?qū)胪緩接幸韵聨追N：①經(jīng)耳蝸開窗,；②經(jīng)半規(guī)管開窗；③經(jīng)圓窗膜注射,；④經(jīng)完整圓窗膜滲透,。

        3.1 耳蝸開窗

        經(jīng)耳蝸開窗后，可以行鼓階或中階注射，相對于鼓階注射,，中階注射能更加直接地將目的基因?qū)雰?nèi)淋巴,，轉(zhuǎn)染效率也更高，文獻報道經(jīng)中階注射AAV后幾乎可以轉(zhuǎn)染耳蝸內(nèi)所有類型的細胞,。然而,，無論是鼓階注射，還是中階注射均會造成一定程度的聽力損失,。

        3.2 半規(guī)管開窗

       半規(guī)管開窗路徑主要是在后半規(guī)管開窗,，動物實驗研究表明此種路徑對聽力的影響較小，但是,，經(jīng)此路徑主要轉(zhuǎn)染前庭細胞,，較少轉(zhuǎn)染耳蝸內(nèi)毛細胞和支持細胞。

        3.3 經(jīng)圓窗膜注射

        將AAV經(jīng)圓窗膜注射途徑導(dǎo)入鼓階后,，目的基因可以表達于外淋巴間隙的間皮細胞,，內(nèi)、外毛細胞,，支持細胞,，螺旋神經(jīng)節(jié)細胞。但是經(jīng)圓窗膜注射容易造成圓窗膜的破裂,，形成外淋巴瘺,，也會對聽力造成輕微的影響。

         3.4 經(jīng)圓窗膜滲透

         經(jīng)完整圓窗膜滲透可以通過鼓室內(nèi)注射或者耳后切開途徑來實現(xiàn),，操作簡單,，對聽力影響小，是向內(nèi)耳導(dǎo)入基因最為理想的一條途徑,。圓窗膜是位于中耳與內(nèi)耳之間的唯一膜性結(jié)構(gòu),，在正常情況下是一半透膜，通透性大小主要與滲透分子的大小,、構(gòu)型,、濃度、脂溶性,、所帶電荷有關(guān),。許多種物質(zhì)包括水、離子,、大分子（如毒素）、抗生素,、直徑小于1μm的微球都能透過圓窗膜進入內(nèi)耳,。然而，作為耳聾基因治療常用載體，病毒卻不易透過圓窗膜,。因此,，許多學(xué)者嘗試采用易化劑（透明質(zhì)酸、膠原酶等）來增加圓窗膜的通透性,。Shibata等發(fā)現(xiàn)使用透明質(zhì)酸預(yù)先處理圓窗膜可以明顯增加圓窗膜對腺病毒的通透性,，從而提高腺病毒在耳蝸內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率。國內(nèi)王慧和夏力使用膠原酶處理圓窗膜后,，通過圓窗膜滲透途徑向豚鼠和小鼠耳蝸內(nèi)導(dǎo)入AAV,，取得了和經(jīng)圓窗膜注射途徑類似的轉(zhuǎn)染效率。

        4 展望

        感音神經(jīng)性耳聾基因治療的基礎(chǔ)研究雖然已經(jīng)取得了很大的進展,，但是要實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化還有很長的一段路要走,。目前限制基因治療向臨床轉(zhuǎn)化的主要障礙是缺乏理想的基因載體和基因?qū)胪緩健＂倩蛑委熭d體,；鑒于非病毒載體的安全性較高,，相對于病毒載體而言，非病毒載體更有希望成為耳聾基因治療的理想載體,。非病毒載體的主要缺點是轉(zhuǎn)染效率較低和缺乏靶向性,，如何提高非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率和靶向性是今后研究的熱點。通過對納米粒子表面進行多種修飾（如穿膜肽和靶向配體）的多功能復(fù)合基因載體也許是人類基因治療載體發(fā)展的方向,。②基因?qū)胪緩?；目前最有希望進行臨床轉(zhuǎn)化的基因?qū)胪緩绞墙?jīng)完整圓窗膜滲透。病毒載體通過新型易化劑對圓窗膜進行預(yù)處理,；非病毒載體通過改變粒徑,，表面電荷，連接穿膜肽等方法有望進一步提高圓窗膜滲透途徑的轉(zhuǎn)染效率,。如果上述問題能夠得到解決,，我們有理由相信在不遠的將來基因治療將成為治療感音神經(jīng)耳聾的有效方法。