腺瘤性結(jié)腸息肉(APC)病基因是結(jié)直腸癌抑癌基因,,可在胚系和體系水平出現(xiàn)異常調(diào)節(jié)。APC位于5q21-q22,,含8535核酸,,21外顯子,編碼310 kDa蛋白,,含2843氨基酸,,75%編碼序列位于外顯子15,是胚系和體突變最常發(fā)生部位,。胚系突變致家族性腺瘤息肉?。‵AP),是CRC主要易感事件,,APC體突變見于>80%散發(fā)CRC,,5q雜合性缺失(LOH)見于30%–40%的CRC。 APC蛋白有多個功能區(qū),,寡聚區(qū)至少保留171個氨基酸用于結(jié)合,,發(fā)揮顯性抑制作用;armadillo重復區(qū)是最保守區(qū)域,,與IQGAP1,、PP2A、Asef和KAP3結(jié)合,,刺激細胞遷移和粘附,;15/20殘基重復區(qū)和SAMP重復區(qū)通過降解β-catenin,負調(diào)節(jié)Wnt途徑,;基礎區(qū)和C末端區(qū)與微管結(jié)合,,直接或間接與EB1作用,,穩(wěn)定微管和著絲粒、促進染色體聚集,??傊瓵PC在細胞遷移、粘附,、增殖,、分化和染色體聚集等過程均發(fā)揮作用(圖1A和1B)。 圖1全長或截短APC主要功能和結(jié)構(gòu) APC基因改變在CRC是早期事件,,但不包括MMR缺陷的MSI表型和CIMP表型,。人類結(jié)腸腺瘤及其鄰近粘膜的外顯子測序顯示APC突變存在于癌前損害,支持其在結(jié)腸腺瘤中是早期事件,,靶向APC可能成為化療預防策略,。CRC共識分子亞型中的CMS2、CMS3和CMS4具有更高頻APC突變,。 Apc突變小鼠模型研究證實,,Apc突變與腸道腫瘤發(fā)生有關,雖然結(jié)直腸癌細胞的雙等位基因均有突變或LOH,,但APC突變通常并不導致APC蛋白完全丟失,,>90%的APC突變?yōu)榻K止密碼子提前,產(chǎn)生截短蛋白,,多發(fā)生在突變簇區(qū)域(MCR),。CRC的APC突變譜見圖2,14.3%是錯義突變,,85.7%為截短突變,。 圖2 CRC中APC突變的分類和分布 FAP和CRC標本可檢測到穩(wěn)定表達的截短APC。CRC中的C末端截短蛋白缺少與微管,、EB1和β-catenin的結(jié)合區(qū)域,,誘導染色體不穩(wěn)定、促進增殖,、抑制分化(圖1B),。目前認為突變致腫瘤抑制功能丟失是結(jié)腸癌開始的關鍵,證據(jù)顯示APC截短后的主要功能有助于結(jié)腸腫瘤發(fā)生(圖3),。下面將討論APC截短后腫瘤抑制功能的丟失以及功能獲得,,并探討其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。 圖3 APC截短在CRC發(fā)生中的作用 CRC中APC的腫瘤抑制功能丟失結(jié)直腸的癌前損害通過原癌基因或抑癌基因的遺傳學改變而發(fā)展為腫瘤,,這一過程為“腺瘤-癌”過程,。APC的C末端序列丟失導致APC腫瘤抑制功能丟失是啟動結(jié)腸癌的必要一步,以下介紹APC在CRC中的抑癌作用。 1.Wnt途徑APC對控制胃腸道細胞分化與增殖的Wnt途徑有負調(diào)控作用,,抑制β-catenin/T細胞因子(TCF)依賴的轉(zhuǎn)錄,,機制包括為β-catenin降解提供場所,促進Axin多聚體化和穩(wěn)定以增加β-catenin降解,,減少核β-catenin水平,,阻滯β-catenin與TCF相互作用,C末端結(jié)合蛋白介導Wnt靶基因抑制,。 APC改變致β-catenin/TCF 轉(zhuǎn)錄活性活化,上調(diào)下游靶,,如細胞周期素D1和Myc,,均驅(qū)動腫瘤形成。強的選擇壓力利于APC保留前20個氨基酸重復序列,,該序列能與β-catenin結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性,,稱作“恰好”模型,APC的基因型選擇與便于腫瘤生長的β-catenin水平相關,。根據(jù)這一模型,,若去除所有β-catenin結(jié)合位點會導致基因調(diào)節(jié)過度變化,細胞死亡風險增加,,而保留部分結(jié)合位點允許轉(zhuǎn)錄活性部分下調(diào),,促進增殖且不誘導細胞死亡。 “三重打擊”假說認為,,對CRC腫瘤細胞來說恰當?shù)腤nt水平在腫瘤進展期間是不斷變化的,,這種變化源于微環(huán)境的變化或獲得其它遺傳學改變,一些CRCs通過調(diào)節(jié)Wnt信號可以有一定反應,?!扒‘?shù)暮溯敵龌钚浴奔僬f認為APC截短導致核輸出活性減少,削弱腫瘤抑制功能,。 2.細胞粘附有研究認為APC失活后通過降低細胞間粘附促進腫瘤發(fā)生,。來自Apcmin/ 小鼠腸道細胞和腫瘤細胞的胞膜E-cadherin水平以及與β-catenin的相互作用下降。截短APC CRC細胞表達全長APC時可致胞膜E-cadherin水平增高,,β-catenin從核和胞漿到細胞周圍,,增加細胞粘附。所以APC通過控制β-catenin和E-cadherin在胞漿和胞膜分布來調(diào)節(jié)細胞粘附,,突變后細胞粘附功能減弱,。 3.細胞周期控制研究顯示全長APC過表達能阻滯血清誘導的G0/G1進入S期,突變APC無此抑制作用,,而短暫過表達全長APC能誘導結(jié)直腸癌細胞株G1期捕獲,,這部分歸因于APC對β-catenin/TCF介導的S期調(diào)節(jié)因素如細胞周期素D1和c-myc的調(diào)控,此外APC可能還以β-catenin非依賴性的方式影響增殖,??傊蛔傾PC的G1/S節(jié)點控制缺陷可致細胞增殖異常,。 4.DNA修復APC主要位于胞漿,可穿梭至胞核調(diào)節(jié)核功能,,如DNA修復,。全長APC能直接結(jié)合Pol-β,、FEN1內(nèi)切酶和APE1內(nèi)切酶,,抑制堿基切除修復(BER)蛋白在受損DNA上組裝,,阻滯長鏈BER,。APC的DNA修復抑制區(qū)是Pol-β和FEN1的結(jié)合位點,,位于N末端,,APC突變時仍存在,,因此多數(shù)截短APC仍能調(diào)節(jié)BER,只是程度不同,。 據(jù)報道LoVo結(jié)腸癌細胞表達截短APC時,加速BER組裝,,APE1,、FEN1和Polβ活性增高;再表達全長APC時減少FEN1表達,,使細胞株對氟脲嘧啶敏感,;APE1活性增加致BER途徑不平衡,,利于染色體不穩(wěn)定(CIN)和癌癥發(fā)展,;APC還能與復制蛋白A32作用,,與DNA雙鏈斷裂(DSB)修復有關,??傊蛔傾PC的BER和DSB修復功能削弱,,CRC累積遺傳學改變,不過CRC細胞具有APC突變時可能對損害DNA的化療藥物更易感,如奧沙利鉑和氟脲嘧啶,。 5.染色體不穩(wěn)定(CIN)中的腫瘤抑制作用APC能結(jié)合并穩(wěn)定微管,,有絲分裂細胞的著絲點處也可見APC與節(jié)點蛋白形成復合物,。U2OS和HCT116細胞敲除APC后,,節(jié)點蛋白與著絲點相互作用減少,,有絲分裂減少,;截短APC基因(Min)細胞的染色體聚集缺陷,;敲除APC和/EB1可致有絲分裂紡錘體和染色體排列異常,;APC截短CRC細胞可見紡錘體結(jié)構(gòu)畸變和著絲點-微管附著削弱;Apc缺陷可致后期橋和染色體數(shù)目增加,??傊瓹末端截短APC因缺少微管結(jié)合區(qū),,導致紡錘體形成異常和有絲分裂異常,,有助于CIN和CRC進展,。 6.APC截短的顯性抑制作用根據(jù)FAP嚴重性和APC截短突變的關系、突變APC蛋白與野生(WT)APC蛋白的關系,,提出APC截短可能因顯性抑制作用失活WT APC,。外源性突變截短APC可拮抗WT APC誘導、Tcf介導的轉(zhuǎn)錄活性下降,。另一項研究中突變APC增加β-catenin水平,,促進細胞增殖和遷移。 然而也有證據(jù)不支持顯性抑制作用,,該研究中無論小鼠是否攜帶編碼Apc1-716(Apc△716/ )氨基酸的轉(zhuǎn)基因,,腫瘤數(shù)量、分布或形態(tài)學并無差別,,因此認為Apc截短并無顯性抑制作用,。矛盾結(jié)果的原因不清楚,。 APC截短:從腫瘤抑制到原癌基因?APC缺陷結(jié)直腸腫瘤中存在雙等位基因改變,,但APC純合缺失少見,,研究顯示APC的“二次打擊”互相依賴,胚系突變發(fā)生在APC MCR時與野生型等位基因缺失相關,,而MCR外突變與截短突變相關,。已有報道MCR胚系突變與息肉增生嚴重性相關,截短APC蛋白的選擇與β-catenin最適宜活性相關,。證據(jù)顯示APC突變后不是簡單的功能丟失,,還可獲得新功能促進腫瘤進展。下面從細胞生存和遷移,、染色體穩(wěn)定性等方面詳述突變APC的功能,。 1.細胞生存全長APC在結(jié)腸癌細胞中過表達時促凋亡,突變后則表現(xiàn)為抗凋亡,,進一步研究證實APC截短蛋白不能被II組半胱天冬酶裂解,,因此無法促凋亡;此外截短APC優(yōu)先定位線粒體,,通過Bcl-2促進細胞生存,;短暫敲除SW480細胞的APC能削弱DNA復制和細胞增殖,該作用通過下調(diào)細胞周期成分實現(xiàn),??傊囟痰鞍拙哂写龠M生存的功能,致CRC能持續(xù)存在并增殖(圖4),。 圖4 CRC細胞在生長和生存上對截短APC的依賴 2.細胞遷移APC 調(diào)節(jié)細胞遷移的機制包括控制actin骨架,,調(diào)節(jié)微管網(wǎng)絡,與Asef,、GEF相互作用,。APC是Asef1的配對結(jié)合體,結(jié)合后增加GEF活性,,刺激Asef介導的細胞扁平化,、膜皺起和MDCK細胞板狀偽足形成。研究顯示外源性截短APC能刺激Asef介導的MDCK細胞遷移,,截短APC敲除能抑制SW480和WiDr細胞遷移,。上述結(jié)果證明截短APC是Asef的活化因子,致細胞異常遷移,。近期研究顯示APC的N末端片段也能引起明顯的細胞遷移異常,。 3.染色體不穩(wěn)定(CIN)中的原癌基因作用某些截短APC對增殖、紡錘體節(jié)點控制,、生存和染色體穩(wěn)定性有調(diào)節(jié)作用,。293細胞表達突變APC(1-1450)時主要損害紡錘體微管,、誘導染色體異常聚集;只表達APC的N末端750氨基酸的細胞的著絲點-微管相互作用削弱,,易發(fā)生CIN表型,;另一研究中APC突變后抑制胞質(zhì)分裂。這些結(jié)果顯示APC突變后能誘導非整體形成,,CIN是否有助于癌癥發(fā)生需進一步研究,。 4.APC截短顯性功能的其它數(shù)據(jù)最近有數(shù)據(jù)支持截短APC的癌基因特征。為闡明結(jié)腸腫瘤發(fā)生的分子基礎,,Zhang教授培養(yǎng)了一系列含端粒酶和CDK4的永生人類結(jié)腸上皮細胞(HCEC),,這些細胞非轉(zhuǎn)化、二倍體核型,、具多潛能干細胞特征,,能分裂形成自組織、陷窩樣的類器官結(jié)構(gòu),,部分細胞顯示成熟上皮標志,。 使用永生的HCECs,Zhang教授研究證實截短APC促使HCECs具有更多腫瘤特征,,異位表達APC1309可中等程度促進增殖,、生長及侵襲,而敲除>90%的WT APC無上述作用,,說明APC功能缺失本身并不驅(qū)動結(jié)腸癌進展,,Pineda的研究結(jié)果與之類似。此外DLD1 CRC細胞敲除截短APC后細胞增殖減慢,,部分細胞死亡,,下調(diào)截短APC能抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤形成。這些結(jié)果支持截短APC能促進腫瘤特征發(fā)生,。 截短APC的CRC細胞在生存和維持腫瘤表型上越來越依賴截短APC(圖4),特別是饑餓狀態(tài)下,,這在腫瘤微環(huán)境下更易發(fā)生,。對突變的腫瘤抑制基因產(chǎn)生依賴的現(xiàn)象稱作“癌基因粘附”。而5q LOH和APC大段缺失的CRC必需進化為不依賴APC功能才能生存,。 有關正常HCECs進展為腫瘤細胞樣HCECs的下游效應子的研究也很重要(工具盒1),,采用結(jié)腸類器官研究截短APC功能也很重要,因為類器官能復制人類CRC進展過程,?!?/p> 遺傳學小鼠模型通過模型不斷研究Apc在腸道穩(wěn)態(tài)和腫瘤抑制方面的功能。第一個遺傳性結(jié)腸癌小鼠模型是多發(fā)性腸道腫瘤(Min)模型,,ApcMin/ 小鼠的Apc密碼子851處為截短無義突變,,可研究Apc腫瘤抑制功能,,但該模型的息肉和良性腺瘤多發(fā)生在小腸。 最近一系列表達截短Apc蛋白的小鼠模型誕生,,多數(shù)模型腺瘤的數(shù)量及分布存在變化,,突變譜與腸道表型間無明確相關性。這些模型有助于發(fā)現(xiàn)與結(jié)腸腫瘤發(fā)生相關途徑,,但也存在一些問題,,特別是統(tǒng)計學上明顯變化的表型,導致表型變化的原因包括WT Apc丟失比例和丟失機制不同,,Wnt信號不同,,遺傳或環(huán)境因素的作用以及使用技術不同。 近期新建立的小鼠模型,,Apc 15個外顯子(Apc△e1-15)全部缺失,,用于檢測截短Apc在腫瘤形成中的作用。該模型腸道息肉分布和組織學改變與ApcMin/ 相同,,但高頻發(fā)生于雌性小鼠,,其腫瘤中Wnt活化水平較ApcMin/ 低,符合“恰好”假說,,即較低β-catenin水平利于腫瘤形成,,但其機制不清。不過這項研究不支持截短Apc的促腫瘤功能,,該結(jié)果的解釋需謹慎,。 所有Apc小鼠模型的共同限制在于大部分腫瘤發(fā)生在小腸,多數(shù)為腺瘤,,較少發(fā)生癌癥,,所以遺傳學工程化特異性Apc損壞的小鼠才可能是結(jié)腸癌研究更好的工具。因此需進一步研發(fā)結(jié)腸特異性Apc小鼠模型,,伴Apc MCR區(qū)域截短,,它能更好的反應人類CRC。 治療潛能APC參與許多與CRC有關的信號途徑和生化過程,,Wnt是受APC截短影響研究最多的途徑,。研究顯示Apc恢復后腫瘤發(fā)生退縮,重新建立陷窩穩(wěn)態(tài),,證實Wnt途徑可作為CRC治療靶點,,各種小分子亦能有效抑制該途徑活性,然而對正常上皮的潛在毒性以及脫靶效應限制了臨床應用,。APC的功能遠不止于Wnt途徑,,但目前幾乎沒有藥物直接靶向非Wnt途徑。 使用上文提到的HCEC細胞株,,小分子截短APC選擇性抑制劑TASIN-1能特異性殺死癌細胞,,抑制APC截短CRC生長,,且對WT APC無明顯影響。機制性研究顯示低血清濃度下,,內(nèi)源性膽固醇生物合成途徑和APC截短發(fā)生協(xié)同致死性相互作用,,特別是TASIN-1誘導膽固醇竭耗后,SREBP2的反饋性活化削弱(圖5),。TASIN-1還有細胞毒作用,,但不依賴Wnt途徑,對正常人類/小鼠結(jié)腸上皮無損害,。 圖5 WT APC細胞中,,TASIN-1誘導膽固醇耗竭,使SCAP構(gòu)象改變,,從INSIG釋放后幫助SREBPs從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運至高爾基體,,經(jīng)S1P和S2P 裂解后轉(zhuǎn)位于核,促進與膽固醇合成和攝取有關的基因活化,,代償膽固醇的減少,,細胞得以生存;低血清濃度培養(yǎng)下,,截短APC削弱了TASIN-1治療后的正常反饋機制,,細胞因膽固醇耗竭凋亡。 該研究開啟了更特異的膽固醇生物合成抑制劑治療截短APC CRCs的研究,,TASIN-1和其類似物代表了靶向CRC治療的模式轉(zhuǎn)換,,突變APC可作為個體化治療的生物標志。需要進一步闡明截短APC與膽固醇穩(wěn)態(tài)間的功能性聯(lián)系(工具盒1),?;蚪M范圍的篩查有助于鑒別其它與截短APC發(fā)生協(xié)同致死性相互作用的途徑及新的治療靶點(工具盒1)。 需強調(diào)的是TASIN-1僅在0.2%血清濃度時才有活性,,強調(diào)低血清/膽固醇培養(yǎng)條件才更接近生理微環(huán)境,,所以有必要重新考慮現(xiàn)在的細胞培養(yǎng)方法,應革新以更好的反應體內(nèi)腫瘤微環(huán)境,。 結(jié)語APC的腫瘤抑制功能是結(jié)直腸癌研究重點,,截短APC具有癌基因功能。APC腫瘤抑制功能丟失和突變體功能的獲得在CRC發(fā)生中發(fā)揮重要作用,。隨著腫瘤進展,細胞信號網(wǎng)絡模式發(fā)生改變,,為了生存和維持其惡性表型,,開始依賴截短APC的癌基因功能(癌基因粘附),不過APC截短癌基因的特征仍需進一步明確,。蛋白質(zhì)組學和基因組高通量篩查有助于鑒別截短APC新的配對結(jié)合體,,以期對CRC信號網(wǎng)絡有更全面理解,。明確APC截短突變體及其下游效應蛋白的功能有助于理解CRC的分子發(fā)生機制,揭示新的藥物靶點,,促進發(fā)展針對CRC的其它靶向治療,。 https://www.ncbi.nlm./pubmed/28423402 19個腫瘤相關臨床試驗招募患者 點擊下方圖片即可查看詳情 |
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