常用的細(xì)菌接種方法有平板劃線分離法,、斜面接種法,、穿刺接種法、液體和半固體接種法,、涂布接種法等,。

一、平板劃線分離法

平板劃線分離法:是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細(xì)胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面,，通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨(dú)立分布的單個細(xì)胞,，經(jīng)培養(yǎng)后生長繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當(dāng)作待分離微生物的純種,。有時這種單菌落并非都由單個細(xì)胞繁殖而來的,，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線”稀釋而達(dá)到分離目的的,。

為方便劃線,，一般培養(yǎng)基不宜太薄，每皿約傾倒20ml培養(yǎng)基,，培養(yǎng)基應(yīng)厚薄均勻,，平板表面光滑。劃線分離主要有分區(qū)劃線法和連續(xù)劃線法兩種（如圖1,， A,、B）。

圖1

分區(qū)劃線法是將平板分四區(qū),，故又稱四分區(qū)劃線法,。劃線時每次將平板轉(zhuǎn)動60~70°劃線，每換一次角度,，應(yīng)將接種環(huán)上的菌燒死后,，再通過上次劃線處劃線；

另一種連續(xù)劃線法是從平板邊緣一點(diǎn)開始,，連續(xù)作波浪式劃線直到平板的另一端為止,，當(dāng)中不需灼燒接種環(huán)上的菌。

1）連續(xù)劃線法

將瓊脂平皿半開蓋倒置于培養(yǎng)箱內(nèi)至無冷凝水,，接種環(huán)于酒精燈外焰燒至紅透,，接種棒也要充分灼燒，最后再集中燒接種環(huán)至紅,。

輕輕搖勻待接種試管,，左手手心托待接種試管底側(cè)部，右手執(zhí)接種環(huán),，右手小指拔下試管塞,，于酒精燈附近將接種環(huán)伸進(jìn)試管，稍候，再插入待接接種液中,，蘸一下,，取滿一環(huán)，抽出,、燒塞,、蓋蓋、放回試管架,?；?qū)⒔臃N環(huán)通過稍打開皿蓋的縫隙伸入平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環(huán)冷卻,，然后以無菌操作接種環(huán)直接取平板上待分離純化的菌落,。

于靠近酒精燈處打開平皿蓋約30°，右手將環(huán)伸進(jìn)平皿,，將菌種點(diǎn)種在平板邊緣一處,，輕輕涂布于瓊脂培養(yǎng)基邊緣（如圖2），抽出接種環(huán),，蓋上平皿蓋,，然后將接種環(huán)上多余的培養(yǎng)液在火焰中灼燒，打開平皿蓋約30°伸入接種環(huán),，待接種環(huán)冷卻后,，再與接種液處輕輕接觸，開始在平板表面輕巧滑動劃線,，接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi)劃破培養(yǎng)基,，線條要平行密集，充分利用平板表面積,，注意勿使前后兩條線重疊,，劃線完畢，關(guān)上皿蓋,。灼燒接種環(huán),，待冷卻后放置接種架上。培養(yǎng)皿倒置于適溫的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（以免培養(yǎng)過程皿蓋冷凝水滴下,，沖散已分離的菌落）,。培養(yǎng)后在劃線平板上觀察沿劃線處長出的菌落形態(tài)，鏡檢后再接種斜面,。

2）分區(qū)劃線法

取菌,、接種、培養(yǎng)方法與“連續(xù)劃線法”相似,。

分區(qū)劃線法分離時平板分四個區(qū),，故又稱四分區(qū)劃線法,。其中第4區(qū)是單菌落的主要分布區(qū)，故其劃線面積應(yīng)最大,。為防止第4區(qū)內(nèi)劃線與1,、2、3區(qū)線條相接觸,，應(yīng)使4區(qū)線條與1區(qū)線條相平行,，這樣區(qū)與區(qū)間線條夾角最好保持120°左右。

先將接種環(huán)沾取少量菌在平板1區(qū)劃3~5條平行線,，取出接種環(huán)，左手關(guān)上皿蓋,，將平板轉(zhuǎn)動60~70°,，右手把接種環(huán)上多余菌體燒死，將燒紅的接種環(huán)在平板邊緣冷卻,，再按以上方法以1區(qū)劃線的菌體為菌源,，由1區(qū)向2區(qū)作第2次平行劃線。第2次劃線完畢,，同時再把平皿轉(zhuǎn)動約60~70°,，同樣依次在3、4區(qū)劃線,。劃線完畢,，灼燒接種環(huán)，關(guān)上皿蓋,，同上法培養(yǎng),，在劃線區(qū)觀察單菌落。

二,、斜面接種法

該法主要用于單個菌落的純培養(yǎng),、保存菌種或觀察細(xì)菌的某些特性。

（1）左手平托兩支試管,，拇指按住試管的底部,。外側(cè)一支試管是斜面上長有菌苔的菌種試管，內(nèi)側(cè)一支是待接的空白斜面,，兩支試管的斜面同時向上,。用右手將試管塞旋松，以便在接種時容易拔出,。

（2）右手拿接種環(huán)（如握毛筆一樣）,，在火焰上先將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部位也過火滅菌．

（3）將兩支試管的上端并齊,，靠近火焰,，用右手小指和掌心將兩支試管的試管塞一并夾住拔出，試管塞仍夾在手中，然后讓試管口緩緩過火焰,。注意不得將試管塞隨意丟于桌上受到沾污,，試管口切勿燒得過燙以免炸裂。

（4）將已灼燒的接種環(huán)伸入外側(cè)的菌種試管內(nèi),。先把接種環(huán)的先端觸及無菌苔的培養(yǎng)基上使其冷卻（如果操作迅速,，此時接種環(huán)尚未完全冷卻）。再根據(jù)需要用接種環(huán)沾取一定量的菌苔,，注意勿刮破培養(yǎng)基,。將沾有菌苔的接種環(huán)迅速抽出試管，注意勿使接種環(huán)碰到管壁或管口上,。

（5）迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接斜面試管的底部,，輕輕向上劃線（直線或曲線，根據(jù)需要確定）,，勿劃破培養(yǎng)基表面,。

（6）接好種的斜面試管口再次過火焰，試管塞底部過火焰后立即塞入試管內(nèi),。

（7）將沾有菌苔的接種環(huán)在火焰上燒紅滅菌,。先在內(nèi)焰中燒灼，使其干燥后,，再在外焰中燒紅,，以免菌苔驟熱，會使菌體爆濺,，造成污染,。

（8）放下環(huán)后，再將試管塞旋緊,，在試管外面上方距試管口2～3cm處貼上標(biāo)簽,。

（9）28℃～37℃恒溫培養(yǎng)。

斜面接種方法及無菌操作過程如下具體操作過程見圖3,。

圖三

三,、穿刺接種法

用接種針經(jīng)火焰滅菌，沾取少量菌種,，垂直地穿入試管固體培養(yǎng)基中心至底部,，然后將挑起菌落的接種針平行于管壁插入瓊脂斜面底部、沿著原接種線將針拔出,、燒試管塞和試管口,、塞上試管塞，再將接種針上殘留的菌體在火焰上燒掉,。要做到手穩(wěn),、動作輕巧快速,。見下圖4。（a:垂直接種法,，b：水平接種法）

四,、液體和半固體接種法

1）液體接種法

包括從外面菌種接人培養(yǎng)液，或從液體菌種接入液體培養(yǎng)液,，兩種情況都可以用接種環(huán)接種,。但在培養(yǎng)量比較大的情況下，液體接種宜采用移液管接種,，要求無菌操作,。

左手持試管，右手將燒灼過的接種環(huán)伸入菌種管,，待冷卻后,，取菌液一環(huán)，立即移入培養(yǎng)基管中,，在接近液面的管壁上輕輕研磨，然后將試管稍傾斜,，并沾取少許液體調(diào)和,，使菌液混合于培養(yǎng)基中(圖5，A)

2）半固體培養(yǎng)基接種法   

將燒灼過的接種針插入菌種管冷卻后,，沾取菌液少許,，立即垂直插入半固體培養(yǎng)基的中心至接近于管底處，但不可直刺至管底,，然后循原路退出(圖5,，B)。管口通過火焰,，塞上棉塞,，接種針燒灼滅菌后放下。

將上述已接種好的培養(yǎng)物,， 37℃度恒溫箱內(nèi)培養(yǎng),，24小時后取出觀察結(jié)果。

五,、涂布接種法

將瓊脂平皿半開蓋倒置于培養(yǎng)箱內(nèi)至無冷凝水,，用無菌移液管吸取菌懸液0.1mL，滴加于培養(yǎng)基平板上,，右手持無菌玻璃涂棒,，左手拿培養(yǎng)皿，并用拇指將皿蓋打開一縫,，在火焰旁右手持玻璃涂棒與培養(yǎng)皿平板表面將菌液自平板中央均勻向四周涂布擴(kuò)散,，切忌用力過猛將菌液直接推向平板邊緣或?qū)⑴囵B(yǎng)基劃破,。接種后，將平板倒置于恒溫箱中,，培養(yǎng)觀察,。（圖6）