基因組注釋的背景知識(shí)（如何判斷基因組的組裝結(jié)果是否可以進(jìn)行注釋）；

重復(fù)序列注釋（重復(fù)序列注釋分類及特點(diǎn),、較常用于注釋串聯(lián)重復(fù)序列分析的軟件等）,；

常見(jiàn)轉(zhuǎn)座元件介紹（LTR、LINE和SINE）,；

不同類型重復(fù)序列預(yù)測(cè)方法及分析流程（從頭預(yù)測(cè)軟件,、同源注釋軟件）。

（以下內(nèi)容根據(jù)華大基因?qū)W院慕序精品在線課程《基因組注釋與基因注釋原理及常用軟件使用方法》整理,，未經(jīng)授權(quán),，不得轉(zhuǎn)載）

（一）如何判斷基因組的組裝結(jié)果是否可以進(jìn)行注釋,？

成功地進(jìn)行基因組注釋的第一步首先要判斷基因組的組裝結(jié)果是否可以進(jìn)行注釋，有以下三個(gè)衡量指標(biāo)：N50,、Gap和Coverage,。

（1）N50的定義

指基因組組裝結(jié)果中，一半的scaffolds/ contigs長(zhǎng)度都大于這個(gè)值,。

（2）N50達(dá)到多少,？我們才可以進(jìn)行注釋？

Contig N50最少要達(dá)到物種平均基因長(zhǎng)度以上,。

（1）Gap的定義

在測(cè)序的時(shí)候,，由于物種本身的限制，導(dǎo)致基因組有些區(qū)域是測(cè)不到的,，或者因?yàn)榛蚪M本身的特點(diǎn),，比如說(shuō)有可能是高重復(fù)或者高雜合，導(dǎo)致基因組上有些序列組裝不出來(lái),。把測(cè)不出來(lái)的或者組裝不出來(lái)的用N去填補(bǔ),，這些填補(bǔ)的區(qū)域就叫Gap，Gap越小越少越好,。

（2）Gap的統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)Gap平均大小和平均個(gè)數(shù),，通過(guò)以上結(jié)果來(lái)考察組裝的結(jié)果。

（1）基因組的覆蓋度

測(cè)序獲得的序列占整個(gè)基因組的比例,，基因組的本身應(yīng)該是多大,，我們裝出來(lái)多大，這樣一個(gè)比值,。我們拿到一個(gè)物種,，一般會(huì)通過(guò)流式細(xì)胞儀的方式去估計(jì)基因組的大小，然后,，我們得到組裝出來(lái)的這個(gè)值和估計(jì)值的比值,，得出來(lái)的這個(gè)值一般在90%-95%即可拿這個(gè)組裝的結(jié)果去進(jìn)行后續(xù)分析。

（2）基因的覆蓋度

我們所組裝的序列中,，基因被完整組裝出來(lái)的比例,。

（3）如何評(píng)估基因覆蓋度？

給大家推薦兩個(gè)軟件——CEGMA和BUSCO,，CEGMA收集了普遍存在于眾多真核生物中單拷貝的基因，我們可以用CEGMA把我們拿到的基因組序列和單拷貝的基因去比較,，如果比到,，證明這個(gè)普遍存在的單拷貝基因被我們組裝出來(lái)了。通過(guò)這樣一個(gè)比值,，我們可以大致判斷組裝的結(jié)果中基因的覆蓋度是不是符合我們的需求,。另外，BUSCO評(píng)估組裝完整度，Complete比例盡量達(dá)到>80%以上,。

（二）基因組注釋

（1）基因組注釋的定義

指在我們感興趣的序列上找到生物學(xué)信息的一個(gè)過(guò)程,，從這個(gè)定義上看，基因組注釋是包括兩個(gè)步驟：

①我們?cè)诨蚪M序列上找到我們感興趣的,、有特定功能的元件,，這也是我們平時(shí)所說(shuō)的結(jié)構(gòu)注釋（Structural Annotation）;

②找到這些元件以后，我們要發(fā)掘這些元件的功能或者它們具有什么生物信息含義,，這也是我們平時(shí)所說(shuō)的功能注釋（Functional Annotation）,。

（2）注釋基因組的思路？

以下兩大思路：

①De novo(Ab initio),，意思是從頭預(yù)測(cè),，我們根據(jù)找到的元件本身的結(jié)構(gòu)特征或者功能特征等等來(lái)識(shí)別它；

②Homology-based,，意思是基于同源性的,，我們認(rèn)為具有序列相似性的元件之間，它們一般具有相似的功能,，基于序列的相似性這個(gè)思路去找到我們感興趣的,、跟我們已知序列非常相近的一些元件。

重復(fù)序列的分類及特點(diǎn)——根據(jù)在基因組上的分布方式,，可以分為兩類：1,、串聯(lián)重復(fù)序列（Tandem Repeats(Satellite)）,它是以特定的單元首尾相接排列在基因組上。2,、散在重復(fù)序列（Dispersed Repeats(Transposons),，TE），它是以特定的單元散在地分布在基因組上,。

（一）串聯(lián)重復(fù)序列

根據(jù)重復(fù)單元的大小分為Satellite(unit>100bp),、Minisatellite（10bp<><><>

較常用于注釋串聯(lián)重復(fù)序列分析的軟件：

(1)TRF（Tandem Repeats Finder）：ab initio prediction，從頭預(yù)測(cè)軟件,，可以機(jī)械地統(tǒng)計(jì)基因組上哪些序列符合串聯(lián)重復(fù)序列的特征（以特定的單元首尾相接排列在基因組上）,。http://tandem./trf/trf.html

（2）RepeatMasker/ RepeatProteinMask：homology-based，同源注釋軟件,，有自帶重復(fù)序列庫(kù),，包含常見(jiàn)真核生物的重復(fù)序列。http://www./

（二）散在重復(fù)序列

根據(jù)散在重復(fù)序列,，也就是我們常說(shuō)的轉(zhuǎn)座子,，它在轉(zhuǎn)座的過(guò)程中是否需要RNA介導(dǎo)分為兩類：Class Ⅰ–（Retrotransposon(RNA intermediate)）和Class II – DNA Transposon(non RNA intermediate)。根據(jù)轉(zhuǎn)座過(guò)程中轉(zhuǎn)座的方式,，我們把Class分為Subclass,，然后根據(jù)插入的機(jī)制,，把Subclass分為Order（詳見(jiàn)下圖）。

我們針對(duì)比較常分析的幾個(gè)轉(zhuǎn)座元件,，介紹一下它們的結(jié)構(gòu)特征,。

LTR ——長(zhǎng)末端重復(fù)序列（Class I，反轉(zhuǎn)座子, 以復(fù)制和粘貼的形式）,，它在植物基因組中比較豐富,，含量比較多，同時(shí)作為基因組大小序列變化主要的因素,。長(zhǎng)末端重復(fù)序列在轉(zhuǎn)座的時(shí)候會(huì)在兩端形成一模一樣比較長(zhǎng)的序列,，中間部分是ORF，編碼轉(zhuǎn)座相關(guān)的酶等等,。

根據(jù)這個(gè)結(jié)構(gòu)特征,，我們可以分析LTR爆發(fā)的時(shí)間，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)座的那一刻,，兩端會(huì)形成的一模一樣序列,，但是隨著時(shí)間的流逝，兩端形成的一模一樣序列會(huì)各自發(fā)生突變,，時(shí)間越長(zhǎng),，突變積累就越多，兩端序列差異也就越大,。我們?cè)跍y(cè)得的物種里面如果找到LTR轉(zhuǎn)座元件,，可以通過(guò)分析兩端序列的差異來(lái)判斷LTR爆發(fā)的年代，這是進(jìn)化分析比較常見(jiàn)和熱門(mén)的點(diǎn),。

LINE以及SINE——分別是長(zhǎng)散在重復(fù)序列/長(zhǎng)散在元件和短散在重復(fù)序列/短散在元件（Class I,，反轉(zhuǎn)座子, 以復(fù)制和粘貼的形式），相對(duì)LTR,，它們?cè)趧?dòng)物基因組中比較常見(jiàn),，含量比較多，尤其是SINE,，它在我們測(cè)的人的基因組有一個(gè)比較常見(jiàn)的子類型叫做Alu,，Alu在人的基因組含量比較豐富，多達(dá)500,000 份拷貝,。

（1）依據(jù)特征的不同,，我們把軟件分為三大類：ReAS、RepeatScout以及RepeatModeler,。這些軟件可以把基因組打斷為若干個(gè)K-mer,，通過(guò)統(tǒng)計(jì)K-mer的頻數(shù)來(lái)判斷該段序列是否重復(fù)足夠次數(shù)，從而找到這些重復(fù)序列,；

（2）基于重復(fù)序列特異的結(jié)構(gòu)特征來(lái)預(yù)測(cè)的軟件,，如LTR FINDER，專門(mén)預(yù)測(cè)LTR轉(zhuǎn)座元件,；

（3）通過(guò)基因組自身比對(duì)的方式來(lái)搜尋重復(fù)序列,，這類常用的軟件有RECON、PILER和RepeatModeler,。

常用的有軟件有RepeatMasker和RepeatProteinMask,，其中，RepeatMasker自帶DNA重復(fù)序列庫(kù),，叫做Repbase,。

我們?cè)谧⑨屢粋€(gè)物種整個(gè)重復(fù)序列數(shù)據(jù)集的時(shí)候，要綜合運(yùn)用以上介紹的軟件,，具體思路請(qǐng)見(jiàn)以下圖片說(shuō)明,。首先，我們拿到基因組序列以后,，先進(jìn)行Tanderm Repeats預(yù)測(cè),，可以使用TRF軟件；接下來(lái),，可以兵分兩路,，第一路：通過(guò)使用De novo軟件（比如：LTR-finder，RepeatModeler, RepeatScout,，Piler等）去預(yù)測(cè)該物種本身特異重復(fù)序列,，然后構(gòu)建出一個(gè)物種本身特異的庫(kù)；另外一路是,，通過(guò)RepeatMasker等可以跟已知的重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)Repbase進(jìn)行比較,，找到已知類型的TEs，然后結(jié)合Repbase和TE proteins這兩個(gè)庫(kù),，重新應(yīng)用RepeatMasker進(jìn)行全基因組的掃描,，最后得出的TEs就基本是全基因組上我們找到的比較全面的TE集合。