高通量測(cè)序的技術(shù)開(kāi)起我們探索動(dòng)植物基因組奧秘的步伐，提到動(dòng)植物基因組測(cè)序,，這就不得不提一個(gè)概念——de novo測(cè)序,。

那么什么是de nove測(cè)序呢，它與重測(cè)序有什么區(qū)別呢,？De nove測(cè)序中Read,、Contig和Scaffold等又代表什么呢？De nove測(cè)序中為什么要建不同大小片段的梯度文庫(kù),？基因注釋又是注釋哪些內(nèi)容,？各位客官別急，且聽(tīng)小編給您細(xì)細(xì)講來(lái),。

De novo是一個(gè)拉丁文，代表從頭開(kāi)始的意思,，而de nove測(cè)序則是指在不需要任何參考序列的情況下對(duì)某一物種進(jìn)行基因組測(cè)序,，然后將測(cè)得的序列進(jìn)行拼接、組裝,，從而繪制該物種的全基因組序列圖譜,。

由于高通量測(cè)序長(zhǎng)度的限制，目前測(cè)序策略是先將基因組打斷小的片段,，然后再對(duì)測(cè)出序列片段進(jìn)行拼接,，最終得到物種的序列圖譜如圖1所示。

 圖1 高通量測(cè)序模式圖

重測(cè)序概念：重測(cè)序是全基因組重新測(cè)序的簡(jiǎn)稱,，是指是對(duì)已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測(cè)序,，并在此基礎(chǔ)上對(duì)個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析。

• 從概念上來(lái)看兩者的區(qū)別在于de nove測(cè)序是對(duì)沒(méi)有參考基因組的物種進(jìn)行測(cè)序,，而重測(cè)序是對(duì)已有基因組的物種進(jìn)行測(cè)序,，這只是它們區(qū)別很小的一部分。

• 從原理上來(lái)看de nove測(cè)序和重測(cè)序最根本的區(qū)別在于de nove測(cè)序需要對(duì)測(cè)序得到的Reads進(jìn)行拼接組裝,，而重測(cè)序得到的數(shù)據(jù)則是沒(méi)有組裝的短的Reads序列,。

值得注意的是，隨著測(cè)序成本的降低以及組裝算法的改進(jìn),de nove測(cè)序成本越來(lái)越低,，目前來(lái)說(shuō)de nove測(cè)序不只對(duì)于沒(méi)有參考基因組物種進(jìn)行測(cè)序,，還可以對(duì)一些特有的亞種,、品種以及變種等進(jìn)行測(cè)序。

Reads：即我們通常說(shuō)的讀長(zhǎng)的意思,，它是指高通量測(cè)序平臺(tái)直接產(chǎn)生的DNA序列,。

Contig：是指Reads基于Overlap關(guān)系，拼接獲得的長(zhǎng)的序列,；

Scaffold：是指將獲得的Contig根據(jù)大片段文庫(kù)的Pair-end關(guān)系,，將Contig進(jìn)一步組裝成更長(zhǎng)的序列；

關(guān)于三者之間的關(guān)系如圖2所示,，注意的是Contig是無(wú)Gap的連續(xù)的DNA序列,，而Scaffold是存在Gap的DNA序列。

 圖2 Reads Contigs以及Scaffolds之間關(guān)系

大片段文庫(kù)是指插入片段大于1Kb的文庫(kù),，大片段文庫(kù)主要是用于將Contig進(jìn)一步組裝成Scaffold。文庫(kù)類型通常有2Kb,、5Kb,、10Kb、15Kb以及20Kb等,。建庫(kù)測(cè)序過(guò)程如圖4所示,。

小片段文庫(kù)是指插入片段小于1Kb的文庫(kù)，小片段文庫(kù)產(chǎn)生的Reads主要用于拼接成Contig,。例如在de nove測(cè)序中,，我們通常要不同梯度下片段如250bp、350bp,、500bp等,；建庫(kù)測(cè)序流程如圖3所示。

值得注意的是除了de nove測(cè)序需要建大片段文庫(kù)外,，其他測(cè)序如重測(cè)序只需建一個(gè)小片段文庫(kù)（250bp）,，而構(gòu)建大片段文庫(kù)過(guò)程繁瑣，價(jià)格較高,。這是de novo測(cè)序比重測(cè)序價(jià)格貴的原因之一,。

圖3 小片段建庫(kù)流程

圖4 大片段文庫(kù)建庫(kù)流程

對(duì)于測(cè)得的序列，例如通過(guò)Hiseq X ten平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,，我們直接獲得是長(zhǎng)度是許多的150bp Reads,；de nove測(cè)序最重要的目的就是對(duì)這些短的Reads進(jìn)行組裝、拼接,，最終繪制出這個(gè)物種的基因組圖譜,。而重測(cè)序則不需要對(duì)Reads進(jìn)行組裝，而是直接將獲得短的Reads序列與參考基因組進(jìn)行比對(duì),，從而找出相應(yīng)的變異位點(diǎn),。這是de novo測(cè)序比重測(cè)序價(jià)格貴的原因之二,。而且組裝周期通常需要很長(zhǎng)時(shí)間，簡(jiǎn)單基因組需要幾個(gè)月左右的時(shí)間,，復(fù)雜基因組需要的時(shí)間則會(huì)更長(zhǎng),。

對(duì)于利用高通量技術(shù)對(duì)物種基因組進(jìn)行測(cè)序，不少人可能認(rèn)為可以得到每條染色體的序列,，這其實(shí)是錯(cuò)誤的,，很多物種得到的序列都是一些長(zhǎng)長(zhǎng)短短的Scaffolds以及一些未組裝的Reads。如果要組裝到染色體水平則需要借助遺傳圖譜的輔助,。對(duì)于一些高重復(fù)高雜合的區(qū)域,，由于目前組裝算法以及測(cè)序技術(shù)的限制，這些區(qū)域往往組裝的效果不是特別理想,。

對(duì)于組裝得到基因組,，如何評(píng)估基因組組裝的好壞呢，我們通常會(huì)聽(tīng)到用ContigN50和ScaffoldN50來(lái)評(píng)估基因組組裝的質(zhì)量,，那么什么是ContigN50和ScaffoldN50呢,？

所謂ContigN50是指將拼接得到的Contig從長(zhǎng)到短進(jìn)行排列，排列成一條線,。當(dāng)長(zhǎng)度達(dá)到總長(zhǎng)度一半的時(shí)候,，此時(shí)該條Contig的長(zhǎng)度即為ContigN50；如圖5所示,，Contig 2的長(zhǎng)度即是ContigN50,。同理，ScaffoldN50是將組裝得到的Scaffold從長(zhǎng)到短進(jìn)行排列,，當(dāng)長(zhǎng)度達(dá)到總長(zhǎng)度一半的時(shí)候，此時(shí)該條Scaffold的長(zhǎng)度即ScaffoldN50,；一般來(lái)說(shuō)ContiN50和ScaffoldN50的長(zhǎng)度越長(zhǎng),，基因組組裝的質(zhì)量也就越好。但是ContigN50和ScaffoldN50也不是唯一評(píng)估標(biāo)準(zhǔn),，還要看基因組的拼接的完整性等,。

除用ContigN50和ScaffoldN50對(duì)基因組進(jìn)行評(píng)估外，諾禾致源還會(huì)對(duì)基因組進(jìn)行序列一致性評(píng)估,、序列完整性評(píng)估,、準(zhǔn)確性評(píng)估、Cegma保守性評(píng)估等,。

 圖5 Contig N50

對(duì)于組裝得到的序列其實(shí)是一系列的ATCG的排列組合,，那如何解讀序列中的信息呢？

我們要做的是對(duì)基因組進(jìn)行注釋,，注釋主要是對(duì)基因組中的重復(fù)序列注釋,、非編碼RNA的注釋,、基因結(jié)構(gòu)的注釋以及基因功能的注釋，注釋的方法有同源注釋以及de nove預(yù)測(cè)等,。重復(fù)序列的注釋主要是串聯(lián)重復(fù)序列注釋（衛(wèi)星DNA,、小衛(wèi)星DNA以及微衛(wèi)星DNA等）和散列重復(fù)序列（LTR、LINE,、SINE以及轉(zhuǎn)座子序列等）,。非編碼RNA的注釋主要是對(duì)MicroRNA、rRNA以及tRNA等注釋,；基因注釋主要是對(duì)基因的啟動(dòng)子,、外顯子、內(nèi)含子等注釋,。

本期全基因組測(cè)序先給大家講到此,，如有疑問(wèn)歡迎大家踴躍留言哈！