鐘金清  廈門蓮花醫(yī)院檢驗科

在日常檢驗工作中，利用生化反應(yīng)曲線尤其是異常曲線來尋找校準(zhǔn)失敗,，質(zhì)控失控及標(biāo)本失真的原因及糾正,，已經(jīng)有很多同行探討過了，也獲得了很大成果,，但對于很多剛?cè)胄械耐蕘碚f,，反應(yīng)曲線到底是怎么回事都不知道，更談不上利用反應(yīng)曲線來排除錯誤了,。本文就以我們科室的貝克曼dxc800生化儀的反應(yīng)曲線來給小白們科普一下到底反應(yīng)曲線是什么,，怎么看反應(yīng)曲線是否異常。

生化反應(yīng)以檢測的方法學(xué)上面大概可以分兩大類：終點法及速率法,。運用終點法的項目包括：TP,，Alb，Ua等,，速率法：ALT,AST,ALP,GGT等,。兩種方法又以與空白吸光度的關(guān)系分成若干個子方法,，其中市面上的絕大部分生化儀多采用終點法2及速率法1，即：將空白吸光度從反應(yīng)吸光度中減去也就是在計算吸光度的時候首先去除了空白吸光度的影響和不將空白速率從反應(yīng)速率中減去,。

生化反應(yīng)：底物A+底物B產(chǎn)物C+產(chǎn)物D,，終點法的原理是：檢測的項目作為底物A或B，當(dāng)反應(yīng)到達平衡時,，檢測底物的消耗量或者產(chǎn)物的生產(chǎn)量,，即可用算出檢測項目的量。速率法的原理是：檢測的項目作為催化反應(yīng)的E,，在保證底物A和B充足的情況下，在反應(yīng)還未達到平衡之前,，檢測底物消耗的速度或產(chǎn)物生產(chǎn)的速度即單位時間內(nèi)的消耗量或生產(chǎn)量,，即可算出檢測項目的催化活性，再換算成相應(yīng)的國際單位,。

下面我們就以TP和ALT來解釋反應(yīng)曲線的來龍去脈,。

上圖是某個項目整個檢測過程的時序圖，從中我看可以看出反應(yīng)開始都是先加入主試劑（試劑1)然后再加入試劑2或者樣品,，然后會讀取空白（這個空白可能是試劑1和試劑2的空白吸光度也可能是試劑1和樣品的空白吸光度）,，如果是三試劑會再加入試劑3，緊接著才開始讀取反應(yīng)吸光度,。這里有一點要注意：當(dāng)樣品加入時,，儀器默認(rèn)這個時間為0，在樣品之前加入的試劑,，時間設(shè)置為負(fù)數(shù),，之后加入的試劑時間設(shè)置為正數(shù)，這一點不同儀器設(shè)置的是不一樣的,。

上圖是TP（單試劑）的設(shè)定參數(shù),，從中我們可以看出第一次加入試劑1（A）300ul，時間默認(rèn)為-180S,，溫育84s（180-96）后后-96至-64s讀取空白吸光度,，0s的時候加入樣品，繼續(xù)溫育,，304至336s讀取反應(yīng)吸光度,。

TP的檢測原理：蛋白質(zhì)是由許多氨基酸通過肽鍵相互結(jié)合而成的，肽鍵在堿性溶液中,，能與銅離子作用產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物,，在540nm有吸收峰，并與蛋白質(zhì)含量成正比,。

蛋白質(zhì)+銅離子→紫紅色絡(luò)合物

上圖為TP的反應(yīng)曲線,，a點（-180s）為試劑1（含銅離子的堿性溶液）加入時間,；b-c（-96至-64s）為試劑空白讀取時間，對應(yīng)的-0.086左右為試劑空白,；d點（0s）為樣品加入時間,，此時反應(yīng)開始，從圖中我們可以看出吸光度快速上升,，說明該波長（540nm）下檢測的吸光物質(zhì)（紫紅色絡(luò)合物）快速大量生成,，并且很快達到平衡；e-f（304-336s）為反應(yīng)讀取時間,，對于終點法來說,，認(rèn)定這個時間反應(yīng)已經(jīng)到達平衡，這是的吸光度(0.110左右)就是反應(yīng)的最終吸光度,，講反應(yīng)吸光度減去空白吸光度就是吸光度的變化值,，這個變化值與樣品中TP的含量成正比。

上圖是ALT的設(shè)定參數(shù),，從中我們可以看出第一次加入試劑1（A）200ul,，時間默認(rèn)為-180S，同時（-180s）加入試劑2（B）40ul,，溫育76s（180-104）后-104至-36s讀取空白吸光度,，0s的時候加入樣品，繼續(xù)溫育,，80至200s讀取反應(yīng)吸光度,。

ALT的檢測原理：ALT催化L-丙氨酸的氨基轉(zhuǎn)移，生成丙氨酸,。丙氨酸與NADH在LDH的催化下反應(yīng)生成乳酸和NAD+, NADH在340nm處有特異吸收峰,，其被氧化的速度與血清中ALT的活性成正比，在340nm處測定NADH下降速率,，即可測出ALT活性,。

上圖為ALT的反應(yīng)曲線，a點（-180s）為試劑1（L-丙氨酸,，LDH）加入時間,，同時（-180s）還加入了試劑2（NADH）；b-c（-104至-36s）為試劑空白（試劑1+試劑2）讀取時間,，對應(yīng)的0.800左右為試劑空白,；d點（0s）為樣品加入時間，此時反應(yīng)開始,，從圖中我們可以看出吸光度慢慢下降,，說明該波長（340nm）下檢測的吸光物質(zhì)（NADH）慢慢減少，并且一直都沒有到達反應(yīng)平衡（平衡時反應(yīng)曲線會變成水平線）；e-f（80-200s）為反應(yīng)讀取時間,，對于速率法來說,，認(rèn)定這個時間反應(yīng)還未到達平衡，這時候曲線下降的速度即曲線的斜率樣品中ALT的活性成正比,。