季博心中有個結(jié),，當年在復旦工作的時候，幫一位臨床醫(yī)生看課題,，結(jié)局是拿了兩個國自然面上,。這個結(jié)局很好嗎？如果好,，就不是季博心中的結(jié)了,。因為，由于實驗技術(shù)的限制,，沒能有5分以上的文章,。

在做科研中,，有兩個事情，一個是提出科學問題后,，我知道怎么去做,。另一個是，我怎么做到,。“知道”和“做到”,。其實國自然中“可行性分析”說是給專家看的，其實是給我們自己看的,。如果一個課題僅僅知道怎么做,，卻不能“做到”，對于臨床疾病的研究,，又有什么用呢,。季博不斷分享高分文章，是想讓大家“知道”臨床科研怎么去做,。而今天要說的東西,，目的是讓您能夠“做到”。

中藥國粹,，期待我輩振興?。?！季博有個美好的愿望,，通過不斷分享高分文章，讓更多的人了解中藥研究,，繼而對中藥研究感興趣,。再加上幫助大家“做到”，從而推動中醫(yī)中藥研究,，加速中藥現(xiàn)代化,。

中藥研究中，大道至簡,，總結(jié)一句話就是“藥物E通過調(diào)控A基因影響B信號通路抑制C疾病的發(fā)生發(fā)展 ”,。不同的疾病，研究的方式稍有不同,。今天以腫瘤為例,。威脅人類健康的三大殺手，第一是心腦血管病,，第二是腫瘤,。為啥不以第一為例呢，因為今天說的是“做到”，從可行性角度,，腫瘤的研究,，從技術(shù)層面，哪怕你在偏遠山區(qū),，只要有簡單分子細胞實驗室,，就可以開展了。

C疾病是我們研究人員自己定的,，藥物E也是我們研究人員自己定的,。那么研究什么呢，最重要的就是A基因了,。藥物下游發(fā)揮功能的基因,，也就是藥靶。所以,，我們的方案,，就是尋找這個A基因-藥物的藥靶。

吉凱基因中藥功能基因研究方案（腫瘤方向）

PS：雖然說是腫瘤方向,，其實其他疾病是相似的,。

1、疾病細胞模型

其實,，在常規(guī)課題設(shè)計中,，季博說“科研第一步是確定細胞模型和檢測指標“。為啥這里不說確定檢測指標呢,，因為這個不用說呀,，藥物治療就是殺傷腫瘤細胞為最終目的。這里的檢測指標就是抑制增殖,，促進凋亡,。

細胞的要求是，a,、可以進行慢病毒感染操作,。目前基因在細胞內(nèi)的操作，最好的工具就是慢病毒介導了,。所以從一開始就高要求,，細胞必須能夠進行慢病毒操作。b,、細胞可以進行高通量功能篩選。為啥加這個呢,，因為這個方案,，是必須確保能夠出陽性結(jié)果。而要必須確保出陽性結(jié)果，一個很好的方式就是高通量篩選（跟國際大藥廠學的,，用的篩選平臺也一樣）,。所以，高要求,，細胞必須能夠進行高通量功能篩選,。

做腫瘤研究的筒子這一步可不用擔心沒好用的工具細胞，吉凱有300株以上的細胞系,，大部分腫瘤都有符合這兩個條件的工具細胞,。

2、藥物功能

a,、在工具細胞上檢測IC50,。很多老師說，我自己做過了,，不用做了,。其實，相同的藥物不同的細胞,，IC50是不同的,。高要求，必須在后續(xù)使用的工具細胞上進行IC50檢測,。

b,、根據(jù)a步驟得出的IC50，在IC50的濃度上邊和下邊各取一個濃度（加上對照是3組）,，采用CCK8檢測藥物抑制細胞增殖情況,，連續(xù)檢測4天。這個步驟是從藥物濃度梯度和時間梯度上證明藥物可以抑制細胞增殖,。

很多老師說,，藥物在細胞上有效了，找藥物下游基因,，加藥和陰性對照做個全基因組表達譜芯片就可以了,。哈哈。您說對了,。不過,，只對了一部分。

1,、差異基因芯片篩選

加藥組和陰性對照組進行全基因表達譜芯片,，尋找藥物處理后改變的基因。這里是做4V4芯片,。為啥組內(nèi)做4張呢,，3張不就有統(tǒng)計學意義了嗎。大家注意，高要求,，因為我們是做藥物,，組內(nèi)可能會偏差大，而組內(nèi)一旦偏差大,，就如老外說的,，“rubbish in, rubbish out”，數(shù)據(jù)基本沒啥用了,。為確保做了就一定能有東西,，組內(nèi)4個重復，在數(shù)據(jù)分析時,，如果有偏差大的樣本,，去掉該樣本數(shù)據(jù)，確保組內(nèi)有3個可靠的重復數(shù)據(jù)進入下游統(tǒng)計分析,。

2,、差異基因與疾病相關(guān)性分析

這一步很多人有疑問。比如我做肺癌,，A基因在肝癌中報道過,，但在肺癌中沒報道過。這個基因好不好呢,。其實,，對于高要求的藥物研究，原則就一個,，在肺癌中沒報道過,。如果在肝癌中報道過，我重點就落藥物和基因的關(guān)系（參考“西蘭花真的可以防癌嗎”里面的6分范文）,。如果基因在其他腫瘤也沒報道過,，我重點就先落基因與腫瘤的關(guān)系（參考“西蘭花真的可以防癌嗎之二”里面的6分范文）。

從分析的基因中,，選取加藥后下降的30個基因,。為啥選擇下降的，因為加藥后細胞死,，基因下降,，后面我采用RNAi人為讓基因下降，如果細胞也死,，說明我們找對基因了,。不過，如果您想做加藥上調(diào)基因,，也可以,，后面高通量功能篩選,，基因操作工具也可以用cas9-SAM進行過表達高通量功能篩選,。不過,，風險大些，您的經(jīng)費要多些,。

1,、候選基因藥物相關(guān)性驗證

選取的30個基因，采用QPCR技術(shù),，在加藥細胞與陰性對照細胞間進行檢測,。確保進入后續(xù)的基因是加藥后下降的基因。這里選擇20個基因進入下游,。

2,、候選基因操作工具制備

這里的基因操作工具是慢病毒介導的RNA干擾。每個基因設(shè)計3條以上片段,，3個片段混合包裝成慢病毒（MIX）,。RNAi-MIX進入下游。

有老師問,，為什么不把這20個基因的有效片段檢測出來后,，用單獨的有效片段去做呢。這個是單個基因研究和大規(guī)模篩選的區(qū)別,，我們也是跟國外大藥廠學習的,。大規(guī)模篩選的目的是縮小范圍，快速并經(jīng)濟的方案是最佳的,。等縮小范圍了,，再細化各個細節(jié)。一般我們20個基因篩選,，陽性率為10%,，會獲得2個陽性基因。如果我一開始,，就把20個基因的有效片段都篩選出來,，大家可以算算，需要的費用和時間,。跟誰比呢,，跟我后面只需做這兩個基因的有效片段驗證，哪個方案更快,，更省,。（額，這算不算商業(yè)機密呀）,。注意,，RNA干擾在沒有獲諾貝兒獎之前,，商業(yè)化提供服務(wù)的時候就說過，一個基因設(shè)計3個靶點,，至少有一個靶點是有效的,。所以，MIX用來進行高通量篩選是最好的選擇,。

吉凱基因現(xiàn)在有現(xiàn)成的文庫,，包括RNA干擾文庫，Cas9文庫（敲除和過表達）,，和過表達文庫,。在工具上達到高通量功能篩選的要求。

3,、高通量功能篩選

核心步驟,。在這一步，我們獲得了,，MIX干擾后細胞增殖受到抑制的基因,。這個基因總結(jié)來說，a,、受藥物調(diào)控,，加藥后下降。b,、采用RNA干擾下調(diào)后,，細胞增殖受到抑制。c,、該腫瘤中未報道過,。這時我們可以叫他藥靶了。

4,、工具驗證

因為就兩個基因,，這時就一個一個做了?？纯茨膫€靶點是最有效的,。后續(xù)的實驗就用這個明確的有效靶點。

這個基因是有功能的,，前面就只有一個細胞功能學實驗,。這里就采用其他細胞功能學再次確證這個基因的功能。

CCK8,、BrdU,、細胞凋亡、caspase3/7活性檢測,、增殖或凋亡marker WB檢測,、克隆形成等,。都是增殖方向的細胞功能學實驗。大家注意,，吉凱基因提供科研服務(wù),，目的是增加您的價值。合作方案到這里,，是有承諾的,。找到的這個基因，在這些實驗中,，至少有3個實驗是陽性的，才算OK,。如果不OK,，返回高通量功能篩選，重新篩,。因為我們有工具庫,，有篩選平臺。一切都為提升您的價值,。

您想申國自然嗎,？到這里，有基因了,，基因與藥物的關(guān)系及基因功能也確定了,。課題的科學性沒有問題了。如果要確保中標率,，就看您寫標書的文字功底了,。

想發(fā)文章嗎？不建議發(fā),，因為,，這個基因是個很好的種子。現(xiàn)在去發(fā)表,，SCI沒有問題,，但分值不高。建議把這個種子養(yǎng)養(yǎng)大,，養(yǎng)大后,，賣個好價錢。啊,，不,，賣個好分值。

如何養(yǎng)呢,？額,，很多人說季博寫東西羅嗦,，今天寫得夠多了。不說了,。想了解怎么把這個種子養(yǎng)大的老師,，跟我們聯(lián)系吧。

一切都為提升您的價值而努力,。

中藥國粹,，期待我輩振興！??！

PS：希望和季博在學習、實驗上有更多交流的朋友們,，可以關(guān)注吉凱基因微信并回復“季博”兩字,。