一 ,、根據標本檢驗目的選擇合適瓊脂平板見表

表：腸道病原菌培養(yǎng)基選擇

注：

1.TCBS：硫代硫酸鹽-枸櫞酸鹽-膽鹽-蔗糖,，XLD：木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽，CCDA：膽酸鹽瓊脂,，CCFA：環(huán)絲氨酸-頭孢西丁-果糖卵黃瓊脂,，SBG：改良亞硒酸鹽磺綠增菌肉湯

2.沙門菌、志賀菌同時接種強弱選擇性不同的兩個平板,。強選擇鑒別培養(yǎng)基可用XLD或用沙門,、志賀菌選擇培養(yǎng)基（SS）；SS對痢疾志賀菌Ｉ型有抑制,，弱選擇培養(yǎng)基可用麥康凱

(MAC)

二 標本接種

    接收標本核對信息后進行編號,并在LIS系統(tǒng)中簽收。

挑取糞便中膿性,、血,、粘液部分或直腸拭子接種于XLD和SS培養(yǎng)基，次日觀察平板生長情況,。為了提高檢測沙門菌陽性率,，可進行SBG增菌培養(yǎng)18～24h。

三 觀察細菌生長情況

觀察細菌在平板上的生長情況, 將其記錄在程序單上（日期,、生長情況,、分純、手工生化,、克氏雙糖鐵斜面或三糖鐵等),。

     (一).血瓊脂平板

查看血平板上是否有金黃色或白色、周圍有明顯的β溶血環(huán)的菌落,，挑取疑似菌落進行涂片,、染色、鏡檢,，確認是否為革蘭陽性球菌,，并同時做玻片法凝固酶試驗。（試管法可同時測定結合型和游離型凝固酶,。）,，若陽性則可能為金黃色葡萄球菌。如果沒有上述菌落,，則繼續(xù)培養(yǎng)24h,。同時檢查有否溶血的革蘭陰性桿菌菌落，此可能為嗜水氣單胞菌或副溶血弧菌,。

（二）.麥康凱瓊脂平板

   用于篩查細菌是否分解乳糖,，沙門菌及志賀菌不分解乳糖，通常呈無色（除宋內志賀菌個別菌株遲緩發(fā)酵乳糖）,。若無疑似病原菌,，而僅有粉紅色的大腸埃希菌落則可接種山梨醇麥康凱瓊脂平板（分區(qū)劃線）以篩檢E.coli O157:H7菌株,，疑似菌落應呈無色；或直接接種于大腸埃希菌0157顯色平板,，該菌落應呈紫紅色,。

  （三）.XLD瓊脂平板

篩查培養(yǎng)基上是否具有無色至粉色半透明菌落或中心具有黑色的紅色菌落，前者可能為志賀菌,；后者則疑似沙門菌,。

  （四）.HE瓊脂平板

觀察是否有藍色或藍綠色菌落存在

  （五）.CCFA瓊脂平板

艱難梭菌在CCFA瓊脂平板上呈圓形，略凸起,，白色或淡黃色,、不透明、邊緣不整齊,、毛邊樣粗糙菌落 ,。

  （六）.TCBS瓊脂平板

在TCBS平板上若有呈黃色、較大,、微凸起的菌落,，則疑似霍亂弧菌；若為綠色或藍色中心,，圓形,，直徑約2-3mm菌落，可能為副溶血性弧菌,，同時有可能為親水氣單胞菌,。

  （七）.CHROMagar TM 沙門顯色培養(yǎng)基(CAS)

呈酒紅色或紫紅菌落。

  （八）.CCDA平板

培養(yǎng)24～48h后,，檢查彎曲桿菌的特征性菌落：有扁平的,、能擴散的、可以彌漫整個平板表面的菌落,；有很小的,、凸起的、半透明的菌落,。顏色可為灰色,、黃色或粉紅色。

四 ,、菌落的挑取

在選擇性平板上挑取可疑菌落是微生物檢驗人員的基本功,。由于在糞便標本中正常菌群多于致病菌，往往致病菌被正常菌群掩蓋,，注意它們之間的區(qū)別,。在挑取單個菌落時，應仔細尋找，不可草率,。在SS平板上,，沙門菌為無色透明、半透明,、中心黑色菌落,；志賀菌為無色透明、半透明小菌落,。在XLD平板上,，沙門菌為無色半透明、中心黑色或黑色菌落,，志賀菌為無色透明菌落,。通常出現上述典型菌落，但也可有非典型菌落,，例如：有些沙門菌不產硫化氫,，在XLD平板上呈淡粉色透明菌落；有些沙門菌可出現粘液型菌落（鼠傷寒沙門菌等）,；有些宋氏志賀菌在SS平板上可為粉紅色。即使從事細菌檢驗多年的人,，也可能被不典型的菌落形態(tài)所迷惑,，因此，在尋找沙門菌和志賀菌時,，應多挑取幾個典型和非典型菌落進行鑒定,，避免漏檢。

五 ,、生化鑒定

（一）.初步生化鑒定

將篩選出的疑似菌落傳代至BAP,、克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）斜面或三糖鐵（TSI）。革蘭陽性球菌做血漿凝固酶試驗,，革蘭陰性桿菌做氧化酶試驗,，凡弧菌屬、氣單胞菌屬,、鄰單胞菌屬,、彎曲菌屬呈陽性；沙門菌,、志賀菌,、耶爾森菌、致病性大腸埃希菌均陰性,。

如果僅要篩檢沙門菌及志賀菌,，從平板分別挑取可疑菌落3～5個分別接種在克氏雙糖鐵（KIA）斜面或三糖鐵（TSI）和動力-吲哚-脲酶半固體（MIU）或腸道綜合雙支糖鑒別管。

（二）.系統(tǒng)生化鑒定 

可根據初步生化反應結果，進行血清凝集試驗;從三糖鐵（TSI）或Kliger氏鐵（KI）培養(yǎng)基內挑取可疑菌落,于玻片一滴鹽水上混勻,再加多價血清,將玻片傾斜數次,迅速而完全凝集為陽性,，然后做血清分型,。

若血清凝集后，須再選擇系統(tǒng)生化,、API20E,、全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)、MALDI-TOF MS進行鑒定,。

（三）抗生素敏感試驗：對所分離的病原菌進行藥敏試驗

六 結果報告：

    查到腸道病原菌,，報告其菌名和藥敏結果。若僅有正常菌群而無病原菌存在時,，則報告：未檢出沙門菌和志賀菌,。

七 操作流程

八 結果解釋

（一）.大便標本應立即送檢或使用Cary-Blair半固體保存培養(yǎng)基或甘油鹽水緩沖液（Buffered glycerol saline solution）運送，否則影響陽性檢出率,。因為志賀菌在大便標本中所能生存的時間極為短暫, 被其他正常菌之代謝物抑制,。分離志賀菌直接接種XLD瓊脂平板（SS瓊脂平板會抑制1型志賀菌），目前沒有一種理想的增菌液（GN肉湯增菌選擇性不強,，其他腸桿菌科的細菌也會生長）,。

（二）.HE瓊脂平板及XLD瓊脂平板最好新鮮配制，SS瓊脂平板,，雖然名稱代表沙門菌及志賀菌,，但據相關文獻報道對志賀菌屬分離不佳。

（三）.空腸彎曲菌培養(yǎng)在42℃微氧環(huán)境（厭氧缸系統(tǒng)不含催化劑）,，至于磷酸鹽緩沖液（PBS）則置4℃冰箱,，CCDA瓊脂平板、Campy-BA平板則培養(yǎng)于微需氧環(huán)境

（四）. 因為志賀菌屬較易死亡,，故采取糞便后應立即接種,。自糞便中挑取黏液塊接種，可獲得較高陽性率,。慢性痢疾患者或者帶菌者亦可采取肛拭進行檢查,，不能立即檢查時，應將標本放入保存液中,。

（五）.挑取的菌落接種于三糖鐵（TSI）或克氏雙糖鐵（KIA）培養(yǎng)基內,。首先穿刺培養(yǎng)基底層達于管底，然后仔細地在全部斜面上劃線,。如接種不好,，則在培養(yǎng)基底層或斜面上生長不良，則可能造成結果誤判,。

（六）. 據文獻報道,，各種平板上沙門菌菌落數和單個菌落生長大小以及對非沙門菌的抑制能力,，以XLD瓊脂平板和科瑪嘉顯色（CAS）相對較好，SS瓊脂平板次之,，HE瓊脂平板較差,。

（七）.引起腹瀉的病原菌很多，當分離糞便中的病原菌時,，報告方式應以檢驗目的菌的結果而定,，如糞便培養(yǎng)（沙門菌、志賀菌）陽性者,，應報告菌名（X沙門菌或X志賀菌）,；陰性者應報告“未檢出沙門或志賀菌”，不應采用“未檢出致病菌”的報告方式,，目前沒有一種選擇培養(yǎng)基能使所有致病菌生長,，未檢出沙門或志賀菌并不意味著不存在有其他病原菌引起的感染。

九 傳染病報告

培養(yǎng)出的腸道病原菌需根據國家相應法律法規(guī)進行傳染病報告流程,，霍亂弧菌同時送各級疾病預防控制機構復核,。