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生物芯片與第二代測序技術是兩種重要的高通量基因組學研究方法,，在生命科學研究領域有著極其廣泛的應用前景,。經過近20年的發(fā)展，生物芯片技術逐漸成熟,，正在向著 “高密度,，靈活定制，微量樣品” 的方向發(fā)展,，從一個實驗室技術發(fā)展成一個基因組學研究所依賴的,，快速產生海量數(shù)據(jù)的常規(guī)手段，正在逐步走向產業(yè)化,。第二代測序技術是最近幾年建立的高通量技術,，其特點是一次測序反應可以產生千萬到億條序列，而測序的成本大大降低,，到2010年已經進入數(shù)千美元測定一個人全基因組的時代,。 上海伯豪生物技術有限公司/生物芯片上海國家工程研究中心受丁香園網(wǎng)站邀請，在其論壇發(fā)布了生物芯片與第二代測序技術答疑專帖,。 以下精選（2010年9月—2011年9月）部分問題,，希望能幫助大家解決針對生物芯片及二代測序方面的疑問！ 問題1. 如果要對人類的腫瘤組織進行全基因組測序,，是進行de novo 還是 Re-Sequence,？人類的全基因組測序結果已經公布（千人基因組），但是腫瘤組織每種腫瘤,、不同病理類型,、不同種族差異很大,。 答：對人類樣本測序都是Re-Sequence,。因為已經有參考序列，在NGS中,，參考序列的意義是搭建一個框架,，然后NGS得到的數(shù)據(jù)就可以根據(jù)這個框架搭建上去（拼接）。 雖然不同的個體,，不同的腫瘤組織基因組序列不同,，但是框架是一樣的。NGS得到的數(shù)據(jù)依靠框架重新拼接起來,，就可以得到各個組織獨特的基因組序列,。 問題2. 我準備在特定病人群取血，測定血漿/血清中的microRNA,但是之前沒有做過這類的試驗,，并且經過我這幾天的資料查詢,，血漿/血清的miRNA只能做表達譜,，但是似乎不能完成功能譜分析，原因可能是量太少,，來源不清等問題?，F(xiàn)在的問題是：正常人血清中也含有幾十種miRNA.如何避免檢測這些miRNA,并且據(jù)文獻報道，血清中的miRNA多以蛋白結合的方式存在,，這對提取RNA是否造成了相當?shù)挠绊懀?br> 答：正常人的血清中是含有microRNA,，但是我們并不需要避免檢測它們。芯片技術發(fā)展到現(xiàn)在,，已經是高通量,，全方面的檢測技術了。microRNA芯片可以將目前已知的所有microRNA的表達水平都檢測一遍,，針對你的樣品,。將病理組織和正常組織的檢測結果相比較，就可以發(fā)現(xiàn)病理組織特異表達的microRNA（表達量增加或者降低）,。這樣的結果還是比較有意義的,。另外，RNA純化方面,。您不用擔心,。像抽提基因組DNA，基因組DNA都是結合核小體的,；抽提RNA,，核糖體RNA還與核糖體蛋白相結合，mRNA還與RNA聚合酶相結合,。結果都抽提的很好啊,。 問題3. 用深度測序做 染色體重排應該建議采用多長的讀段，讀段之間的間隔多少為好,？ 測序的深度測多少合適,？ 答：目前用NGS研究染色體重排一般采用Mate-Pair文庫。讀段之間的間隔的長度沒有標準,，要看你想研究的重排片斷的大小,，用的比較多的應該是2K吧。測序深度至少為30倍,。 問題4. 如果我要對一個病人的家系做全基因組測序,，以探求其可能的致病基因，應該用什么樣的方法比較好,？做GWAS都有什么儀器,？羅氏454是不是其中一種？ 答：GWAS（全基因組連鎖分析）是指比較病人群體和正常人群體之間的基因、外顯子或SNP差異,，從而找到致病基因的技術路線,，目前比較流行。 您對家系的研究不算GWAS,。GWAS是散發(fā)型的Case/control的研究,，一般樣本量大于800例。您對家系的研究,，應該算是連鎖分析（linkage）,，需要至少垂直三代的數(shù)據(jù)。但是比GWAS還是少得多,。目前比較病人群體與正常人群體之間的差異,，一般有第二代測序（NGS）和生物芯片（microarray）兩類。 NGS：基因組重測序（比較基因組差異）,；外顯子捕獲測序（比較外顯子編碼差異）,。 microarray：SNP芯片（比較SNP差異）；CGH芯片（比較基因組結構差異） 你所說的羅氏454是第二代測序的一種,，可以用來做連鎖分析,。但是羅氏454費用較高，一般不推薦,。一般推薦ABI SOLiD,，因為您的研究對象是人，參考序列良好,，而SOLiD測序準確率高,。 問題5. 我要研究一個轉錄因子在肝癌中的作用，使其在肝癌中過表達或低表達后,，用芯片篩選出其調控的基因,，這樣的至少需要幾個樣本（實驗組和對照組各幾個）？ 答：在你的實驗設計中,，首先可以確定樣本可以分為3組：過表達組（上調）,，對照組（不做處理），knock down組（下調,，低表達）,。其次就是確定每組樣本分別設立多少個生物學重復,。生物學重復設立的意義在于,，生物樣品之間存在異質性（差異），即使同樣類型的細胞,，也存在些許的差異,，所以要設立一些重復，以消除生物樣本之間的些許差異。芯片實驗也同樣如此,。一般設立生物學重復的個數(shù)有個原則,，就是當重復個數(shù)多到一定程度，實驗得到數(shù)據(jù)的CV值（變異系數(shù)）趨于穩(wěn)定時,，重復個數(shù)（樣本量）就差不多了,。當然在生物學實驗中，由于實驗的不易和實驗成本的高昂,。大家一般都選取3（能做統(tǒng)計分析的最小樣本量）做為實驗重復次數(shù),。在您的實驗中，不知道您養(yǎng)的細胞的均一程度如何,。anyway,，依照慣例，我還是推薦您做3次生物學重復,。 問題6. 我在試驗上有些困惑,，我用的是agilent大鼠4*24K，可做出的芯片,，每個片子只有幾個點在芯片上染色,，也就10%~30%左右，其余大部分都沒染上,。實驗過程每一步都符合要求的,。不知問題出在哪。 問題7. 請教 miRNA芯片服務和LncRNA芯片服務的價格比較簡單的技術區(qū)別,。 答：miRNA芯片和LncRNA芯片實際上是兩類相差很大的芯片。 miRNA比較短,，因此芯片公司在設計檢測miRNA的探針時,，在探針頭部加了一個發(fā)夾結構，整個探針像一個鉤子一樣,。這樣能將microRNA前體與成熟的microRNA區(qū)分開,，提高檢測的特異性。而LncRNA比較長，檢測LncRNA的探針設計和普通mRNA一樣,。目前LncRNA的研究還不深入,，對于生物芯片之類比較依賴于參考序列的實驗技術來講，LncRNA芯片不是很成熟,。因此,，如果您是想比較兩組樣品之間miRNA的差異表達，可以選用microRNA芯片（定量較準）,。如果您是想發(fā)現(xiàn)新的microRNA,，或者對LncRNA進行研究。我建議您使用第二代測序,。 問題8. 我的課題要求是這樣的： 1,、目前該物種已知的miRNA很少，為了發(fā)現(xiàn)新miRNA,，NGS是肯定要做的,，問題在如果用DGE分析則直接對case和control樣本進行測序，這樣一步到位的拿到序列和表達量的數(shù)據(jù),；如果DGE不可靠則先用混合樣本測序,，然后再定制array分別作case和control的表達譜。您如何看這兩條思路,？ 2,、另一個方面是mRNA表達譜的問題，目前該物種基因組和芯片的注釋均很差,，同樣面臨上述兩條思路的糾結,，mRNA和miRNA的DGE是否有區(qū)別？有無針對mRNA的相關技術手段comparison研究,？ 答：你的是沒有參考序列的物種嗎,？那樣的話，是不能做DGE的,。因為所謂DGE,，實際上就是測序完畢，然后計算tag數(shù),，和SAGE原理一樣,。沒有參考序列的話，就不能計算Tag數(shù)了,。 按照你的情況,，你也不能做microRNA 芯片。因為目前microRNA芯片是不能定制的,。你只能拿case和control來做microRNA-Seq,，從測序得到的數(shù)據(jù)中預測一些microRNA出來,，然后再驗證,。 至于mRNA,。。,。同樣的道理,。你只能做全轉錄組測序。至于比較mRNA的差異表達,，如果樣品數(shù)比較少的話,，可以把所有的樣品都拿去做全轉錄組測序（RNA-Seq）。如果樣品數(shù)比較多的化,，可以先用混合樣品以NGS測表達譜,，然后再定制芯片，對單個個體進行分析,。 下面的文章就是按照這樣的思路做的,。先把混合樣品用NGS測序，然后定制芯片分析個體,。我覺得蠻典型的,，可以借鑒一下。J. CRISTOBAL VERA,CHRISTOPHER W. WHEAT,HOWARD W. FESCEMYER,MIKKO J. FRILANDER,DOUGLAS L. CRAWFORD,ILKKA HANSKI AND JAMES H. MARDEN. Rapid transcriptome characterization for a nonmodel organism using 454 pyrosequencing. Molecular Ecology (2008) 17, 1636–1647. 問題9. 最近了解到有些GWAS研究為了節(jié)約成本,，將大量case和control組DNA分別混合,，然后利用pooled DNA進行genotyping，然后計算各位點基因頻率,，并進行Linkage disequilibrium mapping,； 目前常用的SNP芯片能開展這種實驗么？測定位點基因頻率是否是在比較不同等位基因探針熒光強度的基礎上實現(xiàn)的,？你們能否開展這項實驗,？你們如何評價這項技術呢？ 答：SNP芯片不能開展這樣的實驗,。目前SNP芯片只能用于基因分型,，而不能用于定量。目前,，將case和control分別混合成為一個pool,，用NGS的方法倒是可以計算出SNP頻率。但是這樣的方法有很多的局限：1,、樣品復雜,。有些樣品是組織（包含病理部分和正常組織部分），太多的不同組織混合在一起,，會產生很多背景信號,，從而將所研究的病理部分信號掩蓋掉,。2、pool里面,，不同來源的樣品的量很難一致,。這樣就導致了pool里面樣品量的不均一，對最后結果產生影響,。3,、頻率不準。NGS在構建文庫的時候,，有個PCR過程,，這樣會造成最后結果和原始樣品中的比例不成線形關系。所以,，目前GWAS還是一個樣品一個樣品的分型的,。 問題10. 我想研究某種疾病的易感基因，或者說是疾病的發(fā)生是否與基因水平的異常有關,，如果較難做到家族分析,，又很難得到大量樣本，簡單的用全基因組芯片測幾個病人似乎有不太能說明問題,，此時該選用什么方案呢,？ 答：那是很難的。用全基因組SNP芯片來比較病人和正常人在DNA水平上的差異,，會得到很多差異結果,，不能將疾病定位于某個基因上。這個時候擴大樣本量,，能慢慢的縮小目標,，這就是GWAS需要很多樣本的原因。如果沒有大樣本,，又沒有家系,，是很難將疾病定位于某個基因上的。除非運氣特別好,，研究的疾病是由大范圍的基因組片段缺失引起的,，很容易檢測出來的那種。 問題11. 請教樓主幾個問題： 1.現(xiàn)在一般測幾個bp,？主流是多大的,，而且保證較低的假陽性率。 2.假陽性率是怎么計算的,？ 3.不同的樣品測到什么深度比較合理,？比如細菌和人組織。 4.不同深度的結果能夠比較嗎,？ 5.深度測序得到的是絕對拷貝數(shù),，那么不同實驗室得到的一個定量列表有可比性否,？ 答：1. 我不清楚您是指需要測多少bp，還是能測多少bp,。目前在保證較好數(shù)據(jù)質量的情況下,，三大主流平臺，Roche 454 GS FLX Titanium能測450bp,；Illumina HiSeq 2000能測100bp（單向）,；SOLiD 5500xl能測75bp（單向）,。至于需要測多少bp,，這樣實驗目的不同要求也不同。比如microRNA測序,，測35bp也足夠了,；而基因組重測序，那肯定是越長越好,。 2. 假陽性率就是數(shù)據(jù)的保真性,，Illunima是這樣的，它提供一份已知序列的混合樣品,，然后測序,，和已知數(shù)據(jù)比較，然后計算假陽性率,。在三大平臺中,，ABI SOLiD的系統(tǒng)準確性最高，最新公布的SOLiD 5500xl的準確性達99.99% 3. 這個也是需要看實驗目的,。比如檢測SNP的全基因組重測序,，如果您只想檢測到出現(xiàn)頻率為25%以上的SNP，那么理論上只要覆蓋4次就可以了（4次里面出現(xiàn)一次,，就是25%）,；但是如果想檢測出現(xiàn)概率為1%的SNP，那么就覆蓋倍數(shù)必須達到100倍（100次里面出現(xiàn)一次）,。 4. 如果是基因組結構變異,，那么是可以比較的。而其他的,，則要視具體情況而定,。 5. 那個需要看總的Reads數(shù)是否差不多，如果數(shù)據(jù)量差不多的話,，那么定量列表還是差不多的,。 問題12. 請比較454和solexa技術的優(yōu)劣，如果做宏基因組,，選用哪種適宜,？ 答：454的優(yōu)勢在于讀長很長,，在沒有參考序列的情況下，拼接方便,。因此很多de novo測序就是用454進行的,。但是454的Reads數(shù)很少，因此一些需要很高覆蓋倍數(shù)的應用不推薦454,，比如運用高通量測序計算SNP頻率,。solexa和454相比而言，Reads多,，但是讀長短,。目前solexa最新款的HiSeq 2000官方宣稱能單向測100bp，但是在實際應用中,，單向能測到150bp,。100bp的讀長在de novo測序中也勉強能用了，雖然mapping比較麻煩,。因此近幾年來,，也有很多用Solexa進行de novo測序的文章出來。以上的觀點僅僅考慮技術,。但在實際應用中,，也需要考慮使用成本。目前,，在第二代測序中,，454的成本遠比solexa和ABI SOLiD貴，因此454的應用不是很廣,。 問題13：我們需要做感染組和未感染組細胞的MicroRNA芯片和二代測序（轉錄組）有幾個問題需要請教一下： 1.我們的細胞是模式生物,，genome已知，我們想通過二代測序找到所有已知和未知的mRNA和microRNA,，看您前面有個帖子說不建議這兩者一起測,，一般是將microRNA分離單獨測，那這樣就是算進行了兩次測序,，價錢也要翻翻,，是吧？按照之前您說的三種二代測序儀器的比較,，我覺得SOLID比較合適microRNA測序,，那如果確實是分開兩次測序，需要用一樣的儀器么,？Solid讀長有點短,，用來測mRNA好么？ 2.二代測序可以直接將感染后高表達,、低表達的mRNA,、microRNA篩出來,，但是我學習之后覺得這應該只是一個高通量的測序技術?？汕懊鎽?zhàn)友說的DGE（數(shù)字表達譜）又讓我覺得困惑了,，是不是只有這種方法可以實現(xiàn)差異比較？ 答：第一個問題是“想找到所有已知和未知的mRNA和microRNA”,。對于這個實驗目的,，我想目前只有第二代測序才能完成（生物芯片只能檢測已知的mRNA和microRNA的表達）。目前,，對于RNA的測序,。microRNA和mRNA確實不能在一次測序反應中同時檢測，必須分開,。因為在測序的過程中會選擇一定大小范圍的核酸進行測序,，而microRNA和mRNA大小差異很大,，不能同時選擇,。SOLiD測microRNA確實蠻合適的，但是SOLiD也可以測mRNA,。不過您也可以選擇用Solexa測mRNA,。 第二個問題是“將轉染后高表達、低表達的mRNA,、microRNA篩出來”,。其實就是篩選差異表達，這個實驗目的有三種方法可以實現(xiàn),。1,、DGE：國內某些公司仍在提供DGE服務，但是已經不是發(fā)展趨勢了,。2,、RNA-Seq：用第二代測序測一遍RNA，然后用生物信息學的方法計算出表達量,。3,、生物芯片：發(fā)展時間很長,，比較成熟,，特別是表達譜芯片,。microRNA也有相應的生物芯片來檢測,。我建議你用生物芯片。因為生物芯片沒有第二代測序建庫時PCR擴增的過程，樣品不會失真,。而生物芯片發(fā)展成熟,，后續(xù)數(shù)據(jù)分析也很簡單,。而且價格比測序便宜,。 問題14. 我做了基因芯片檢測,，其中有一個問題：不知道標記A和P的基因A比P大于多少才可以用于基因摔選？需要多少樣本達到那個標準才可以,？ 答：您可能是想問基因芯片實驗最后的檢出率達到多少才是可以用的結果,。實際上關于芯片檢出率的問題，應該說沒有一個統(tǒng)一,，也不應該有統(tǒng)一的標準,，因為芯片只是工具，而實驗得到的數(shù)據(jù)只是把樣本里基因表達的信息以數(shù)據(jù)的形式反映出來,，所以檢出率是樣品本身的屬性,，不是評價芯片實驗質量的指標,。agilent或者affymetrix公司都沒有明確說多少是好或者不好。而且即使對于同一個物種，比如人，不同材料檢出率也不同,，比如,，組織的檢出率要明顯高于細胞。但是一般來說相同樣品的檢出率相差應該不超過±5%,。同一批樣品檢出率應該相差不大。 問題15. 我想在一個細胞給藥前后觀測非編碼RNA的水平差異,，包括成熟miRNA及前體pri-miRNA和pre-miRNA表達差異，以及l(fā)ncRNA,。貴公司二代測序能觀測這四類分子嗎,？ 答：測序是都能測的。但是由于lncRNA,、pri-miRNA和成熟的miRNA大小不一樣,。所以不能在一次測序反應中全部檢測到，需要分開幾次測,。 第二代測序的建庫和后續(xù)測序反應都要求樣品的長度基本一致,，這樣測序的效果才好。 問題16. 檢測成熟miRNA及前體pri-miRNA和pre-miRNA,，以及l(fā)ncRNA在給藥前后的差異,，芯片能否也可以做到？與貴公司二代測序相比,，哪種方案更經濟可行呢,？ 答：目前Agilent和Affymetrix有檢測miRNA的產品，不過它們只能檢測成熟的miRNA,。Affymetrix miRNA Array第二版能檢測pre-miRNA,，但是要到今年2月份后才會推出來。有一些芯片可以檢測lncRNA,，例如Agilent的新版8*60表達譜芯片里面就集成了一些lincRNA探針,。不過目前針對lncRNA的研究還不全，很多l(xiāng)ncRNA都是未知的,。所以對于lncRNA而言，還是測序的好,。針對你的情況,。比較好的方案是樣品一分為二，一份來用分離pri-miRNA,、pre-miRNA和lncRNA,，進行長片段RNA的測序；另一部分分離成熟的miRNA,，進行小片段RNA的測序,。 問題17. 我想用不同中藥干預腫瘤細胞生長,，通過基因方面研究藥物有效，方法一：抽取組織RNA,做芯片,，測基因表達差異,，這個差異有無具體指標？殺死動物的時間有無差異,，比如說干預1個月,，2個月，3個月,？方法2,有無其他基因指標說明藥物有效,？ 答：一般來講，基因方面是不能做為藥物有效的指標的,。因為疾病的影響因素很多,，基因表達調控的網(wǎng)絡很復雜，在某一疾病和某些基因的表達變化之間很難建立比較確切的關系,。一般都是通過其它方法確定某種藥物確實有效,，然后用基因芯片等研究藥物發(fā)揮作用的機制。驗證藥物有效的方法一般是比較用藥組與非用藥物腫瘤的大小,，生長速度等,，或者疾病的不同，有一些不同的檢測方法,，這些需要看前人是怎么做的了,。 問題18. 有2個問題： 1，對于尋找藥物影響厚的相關因子的信號通道,，你們公司有什么試劑盒,？什么試驗方法,？ 2.Rt-PCR驗證試驗里，對表達差異顯著的因子，不同時相的表達差異以及cDNA芯片驗證,，簡單的方法如何？ 答：1,、尋找藥物發(fā)揮作用的信號通路,。就像上次跟您說過的那樣，可以先用表達譜芯片找出差異表達的基因,，然后用生物信息學的方法找到差異表達的基因分別歸屬于哪些信號通路,。這樣我們就找到了藥物影響的信號通路了。生物芯片實驗和后續(xù)的生物信息學分析,，我們SBC都可以幫您完成,。只要您提供樣品，我們就能把實驗結果交給您,。 2,、后續(xù)芯片實驗結果的驗證,，最常用的有兩種： A：RT-PCR。抽提樣品的RNA,，逆轉錄,，做熒光定量PCR。因為生物芯片實驗是高通量的實驗（同時檢測幾萬個基因）,，所以精確度和一次只分析一個基因的實驗是沒法比的,。因此一般而言，芯片實驗后常用RT-PCR來驗證一下,。 B：Western Blot實驗,。芯片實驗和RT-PCR只在mRNA水平上檢測，但實際上mRNA水平和蛋白水平并不是線形的關系,。而發(fā)揮作用的一般是蛋白質,。所以芯片實驗后，保險起見,，一般也會用Western檢測蛋白水平是否真的有變化,。 問題19. 二代測序在篩查未知突變的靈敏度上與傳統(tǒng)測序有差別嗎？比如對腫瘤體細胞中低拷貝核酸突變的篩查,。 問題20. 想比較癌組織和癌旁組織miRNA表達譜差異，篩選出差異較大的幾個再做RT-PCR,，芯片部分可以用樣品混合做嗎,？還是必須每個癌組織和癌旁組織單獨做。另外,，技術重復和生物學重復分別定為多少為好,？ 答：生物樣品都有異質性，因此如果把幾個生物樣品混合起來的話,，那么那些特異性的東西可能會被平均化，掩蓋掉,。特別是腫瘤組織這樣異質性很強的組織（腫瘤組織中除了腫瘤細胞外,，還有正常細胞）,。因此，我們一般不推薦做混合樣品,。不是因為不能做,，而是因為有風險。目前,，技術重復已經不需要了,。混合樣品的話,，生物學重復也沒什么必要,。。相反,，如果您想做生物學重復的話,，建議還是比較單個腫瘤組織VS癌旁，這樣的生物學重復才有意義,。 問題21. 在基因水平比較一下,，三種用于體內移植的干細胞的致瘤性差異，看哪種細胞的生物安全性最高,，不知是否適合做基因芯片,？是否需要陰性對照組，該怎么設計實驗才合理,？如果可以應該選擇哪一種芯片,？或該用著其它什么方法？ 答：評價干細胞的致瘤性,，我想最直接的方法還是細胞,、動物實驗。至于在全基因組水平上評價干細胞的致瘤性,，我想可以用表達譜芯片,。比較干細胞和它要分化成的終末細胞之間的表達譜，如果表達譜相近,，那么說明只需要少量的分化就可以轉化為體細胞,，安全性應該較高吧。當然,，表達譜芯片的數(shù)據(jù)只能做為參考,，具體的干細胞致瘤性還是需要別的實驗來驗證的。近期,，我們有位客戶在nature上發(fā)表了一篇文章：http://www./show_news.asp?id=1120,。他的研究內容是：通過慢病毒轉導編碼轉錄因子的基因，將成纖維細胞轉化成為肝臟細胞,，最后用表達譜芯片比較轉化型肝臟細胞和正常肝臟細胞的表達譜,，并且配合一系列其它實驗,，證明轉化成功。 問題22. 現(xiàn)在有一種說法是測序正在逐步的取代芯片,，測序是通過數(shù)字信號可以測到低到兩個拷貝的表達,，周期，質量,，性價比都超過芯片的,。是這樣么？如果按照前面我提問的關于做mirna表達譜和mrna表達譜的話,？ 答：做為基因組學研究的兩大技術手段,，基因芯片和第二代測序之間的比較是個永恒的話題。由于兩者之間一些共同的特點（比如說高通量）和一些應用領域上的重合（比如表達譜,，SNP）,，大家習慣于把這兩者放在對立的位置上，其實大可不必,?；蛐酒偷诙鷾y序在本質上是兩種不同的技術。1,、基因芯片的本質是核酸雜交,。只不過是同時進行上萬個核酸雜交而已。2,、第二代測序在本質上是先用PCR的方法構建測序文庫（SOLiD的油包水PCR,，Solexa的橋式PCR），隨后再以“邊合成邊測序”或者“連接介導的測序”,，得到序列信息,。從本質上出發(fā)，就能對基因芯片和第二代測序有更深的認識了,。由于是核酸雜交,，不需要擴增。因此基因芯片是個相對封閉的系統(tǒng),，只能檢測序列已知的片段的濃度,；另外，由于不需要擴增,，保真性也較好,。第二代測序本質上是測序，因此是個開放的系統(tǒng),，能檢測到那些沒有參考序列的片段,，并且給出序列。由于在構建測序文庫的過程中有PCR放大的過程，因此相對靈敏度較高（需要高覆蓋倍數(shù)的測序深度配合）,，但也由于PCR放大過程的不均衡性,，樣品中片段的內在濃度比例常常會被破壞掉。因此,，基因芯片和第二代測序技術在應用上雖然有交集，但還是有差別的,。如果是比較參考序列良好的物種的表達譜,，基因芯片好一些，而且基因芯片發(fā)展成熟,，后續(xù)數(shù)據(jù)分析較方便,。而如果想發(fā)現(xiàn)新的轉錄本，或者研究基因表達的可變剪接,，3’UTR的變化等等,，還是用第二代測序的好。我們現(xiàn)在傾向于認為基因芯片和第二代測序技術是兩種不同的技術,，兩者有交集,，但更多的是不同。至于選擇哪種技術,，還是要看具體想解決的問題是什么,。 問題23. 關于從RNA seq數(shù)據(jù)中得到transcript或者gene表達量的問題。請問你們有什么方法能夠推薦一下么,？我現(xiàn)在用bowtie作比對,，然后用tophat得到bam文件，然后用cufflinks處理,，但是這樣下來,，我輸入1G 的序列，最后只得到幾條序列的結果,，是怎么回事呢,？ 答：你的情況是否是參數(shù)的問題，一般的tophat需要格式化過的參考序列（bowtie-build做）,，還需要一個gtf格式的注釋文件,。結果會得到一個sam文件，使用cufflinks處理sam文件,，就可以得到有關的差異表達的結果,。 From：http://hi.baidu.com/new/u200713054 |
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