l 儀器與試藥

 1．1 儀器

 Sartorius BP211D型電子分析天平(德國(guó)),，F(xiàn)w177型 中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)，Waters2690 高效液相色譜儀,，Waters996二極管陣列檢測(cè)器,，Millenni— urn32色譜工作站，H66O25T型超聲清洗儀,。

 1．2 試藥

 杜仲原藥材購(gòu)自西安市藥材市場(chǎng),，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院中 藥教研室王繼濤教授鑒定為杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliv．)的干燥樹(shù)皮 綠原酸對(duì)照品(購(gòu)于中國(guó)藥 品生物制品檢定所，批號(hào)：0753—200111),。流動(dòng)相所用甲醇 為色譜純,，水為重蒸水(實(shí)驗(yàn)室自制)，鹽水均為2％的食鹽 水溶液,，磷酸等其它試劑均為分析純,。

 2 方法與結(jié)果

 2．1 不同炮制品的制備

 杜仲生品的制備：將杜仲除去粗皮，洗凈潤(rùn)透,，用切藥 刀切成3~4mm的橫絲(垂直于膠絲的生長(zhǎng)方向),。

 不同炮制品的制備：

 清炒法：取100g杜仲絲置炒制容器內(nèi),，中火炒至顏色加深，有焦斑,，絲易斷時(shí),，取出晾涼。

 鹽炒制1：取100g杜仲絲,，置容器內(nèi)加鹽水拌勻,，加蓋 悶潤(rùn)。待鹽水被吸盡后,，置炒制容器內(nèi),，中火炒至顏色加 深，有焦斑,，絲易斷時(shí),，取出晾涼。

 鹽炒制2：取lOOg杜仲絲,，置炒制容器內(nèi),，中火炒至顏 色加深，有焦斑,，絲易斷時(shí),，取出，噴淋鹽水拌勻,，再置炒制 容器內(nèi)炒干,，取出晾涼。

 鹽制砂炒1：將河砂置鍋內(nèi)炒至靈活狀態(tài)后,，取用鹽水 悶潤(rùn)好的杜仲絲100g傾人鍋內(nèi),，中火反復(fù)翻炒20min，取 出晾涼,。

 鹽制砂炒2：將專用溫度計(jì)置入鍋內(nèi),，放入適量細(xì)砂， 將100g杜仲絲置入鍋內(nèi),，中火反復(fù)翻炒20min后取出,，篩 去細(xì)砂，噴淋鹽水拌勻,，再置炒制容器內(nèi)炒干,，取出晾涼。

 鹽蒸制：取100g杜仲絲,，置容器內(nèi)加鹽水拌勻,，加蓋悶 潤(rùn)。 待鹽水被吸盡后,，置鍋內(nèi)中火蒸制1h,，取出晾涼,。

 2．2 色譜條件

 色譜柱：Welch Materials C18(4．6ramX250mm，5p．m),； 流動(dòng)相：甲醇一O．4％磷酸溶液(25：75),；柱溫：25℃ ；檢測(cè)波 長(zhǎng)：327nm,；流速：1mL·min ,；進(jìn)樣量：1％I

 2．3 對(duì)照品溶液的制備

 取綠原酸對(duì)照品,，精密稱定,，加甲醇溶解、定容,，制成每 1mL含綠原酸0．406mg的對(duì)照品溶液,，備用。

 2．4 供試品溶液的制備

 取上述不同炮制品粉末各1g,，精密稱定,，置于三角瓶 內(nèi)，精密加入甲醇25mL,，稱重,，超聲lh，取出,，用甲醇補(bǔ)足 缺失量,，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液,。

 2．5 線性關(guān)系考察

 精密吸取綠原酸對(duì)照品溶液1mL,，置10mL量瓶中，加 甲醇稀釋至刻度,，搖勻,，分別精密吸取8、10,、12,、14、16,、18,、 20 L，按2．2項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定,。以進(jìn)樣量( g)為橫坐 標(biāo),，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸,，得回歸方程為：y一 3174278．9899X+1505．6609(r一0．9996),，結(jié)果顯示,，綠原酸對(duì)照品在0．324~0．812~g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

 2．6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

 取同一供試品溶液,，按上述色譜條件,，分別于0、2,、4,、 6、8,、10,、12h進(jìn)樣10gL，測(cè)定綠原酸的峰面積,。結(jié)果表明,， 供試樣品在12h內(nèi)峰面積穩(wěn)定，RSD為1．62 ,。

 2．7 精密度試驗(yàn)

 取同一供試品溶液IO／~L,，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5 次,，測(cè)定綠原酸的峰面積,。結(jié)果表明，精密度良好,，RSD為 0．97 ,。

 2．8 重復(fù)性試驗(yàn)

 取同一樣品共5份，照“供試品溶液制備”項(xiàng)下的方法 制備供試品溶液,，按上述色譜條件,，測(cè)定綠原酸的峰面積。 結(jié)果表明,，本方法重復(fù)性良好,，RSD為0．59 。

 2．9 加樣回收率試驗(yàn)

 取已知含量的樣品6份,，精密加入一定量的綠原酸對(duì) 照溶液,，照“供試品溶液制備”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液， 按上述色譜條件,，取1O“L注入液相色譜儀,，測(cè)定綠原酸的 峰面積，計(jì)算回收率,。結(jié)果表明,，綠原酸的平均回收率為 99．92 ，RSD為1．68 ,。結(jié)果見(jiàn)表l,。

 2．1O 樣品的含量測(cè)定

 分別吸取各供試品溶液10ttL,，注入液相色譜儀，按2．2 項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定,，記錄峰面積,，由回歸方程計(jì)算綠原酸 的含量，結(jié)果見(jiàn)表2,，對(duì)照品及樣品HPLC色譜圖見(jiàn)圖1,。

 結(jié)果表明：不同炮制樣品中，綠原酸含量：鹽蒸制>鹽制 砂炒2>鹽炒制2>鹽制砂炒1>鹽炒制1>清炒>生品,。

 3 討論

 (1)流動(dòng)相的選擇,，通過(guò)對(duì)乙腈一不同濃度磷酸溶液系 統(tǒng)，及其乙腈一磷酸溶液不同比例的洗脫系統(tǒng)進(jìn)行考察,，最 終選擇甲醇一0．4 磷酸溶液(25：75)出峰較為理想,，可達(dá) 到基線分離,。

 (2)對(duì)于檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇,，進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，綠原酸選用327nm,，系統(tǒng)穩(wěn)定性好,，干擾小。

 (3)通過(guò)對(duì)不同炮制方法對(duì)杜仲中有效成分影響的實(shí) 驗(yàn)研究,，結(jié)果表明,，生品的綠原酸含量明顯低于各炮制品， 這可能是由于生品杜仲中橡膠絲的作用使其有效成分難以 溶出,，這為傳統(tǒng)的“炒斷絲”炮制標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù),。

 (4)鹽制杜仲中綠原酸的含量普遍高于清炒法和生品， 這為鹽制入腎的傳統(tǒng)用藥理論提供了科學(xué)依據(jù),。

 (5)通過(guò)對(duì)不同鹽制杜仲方法的比較,，結(jié)果表明，砂炒 杜仲中綠原酸的含量高于不加砂的炮制方法,，這可能是由 于砂可以提高炒制溫度,，傳熱也比較均勻，進(jìn)而提高了杜仲 的斷絲率所致,。

 (6)鹽蒸制杜仲中綠原酸的含量最高,，但是否優(yōu)于傳統(tǒng) 的炒制法，還有待于進(jìn)一步研究,。