刺五加葉是五加科植物刺五加Acanthopanax seuticosus (Rupr. etMaxim.) Harms的干燥葉片^[1],，臨床研究表明刺五加葉中含有大量對人體有益的生物活性成分,，具有調(diào)節(jié)機體免疫力、預(yù)防心腦血管疾病及改善睡眠等功效^[2],。隨著近年來對刺五加葉的開發(fā)利用不斷增加,，刺五加葉顆粒、袋泡茶及刺五加葉腦欣通等一系列產(chǎn)品相繼推出^[3-4],。但現(xiàn)階段對刺五加葉的研究多集中于化學(xué)成分^[5-8],、藥理作用^[9-11]以及現(xiàn)代應(yīng)用^[12-14]等方面，對刺五加葉采收期的研究鮮有報道,，而適宜的采收期是保證刺五加葉質(zhì)量的重要環(huán)節(jié),。因此，采收期的研究對刺五加葉的開發(fā)利用具有重要意義,。

目前,，對刺五加葉適宜采收期研究的考察指標(biāo)較單一，難以客觀,、全面地反映不同時期刺五加葉的內(nèi)在品質(zhì)，如陸珞等^[15-17]以紫丁香苷,、黃酮類和多糖為考察指標(biāo)對刺五加葉的采收期進行了研究,。近年來研究發(fā)現(xiàn)刺五加葉苯丙素類成分含量較高，并且具有抗炎,、抗氧化等作用^[18],；原兒茶酸是多種中藥的活性成分，如益智仁,、丹參,、芙蓉等,，而刺五加葉中原兒茶酸的研究較少，關(guān)于原兒茶酸的藥理作用已有大量報道,，其具有良好的抗氧化和神經(jīng)保護的作用^[19-20],。因此，本實驗選取苯丙素類的L-苯丙氨酸,、紫丁香苷,、綠原酸、咖啡酸,，黃酮類的蘆丁,、金絲桃苷、槲皮素及原兒茶酸作為考察指標(biāo),。此外,，產(chǎn)量也是判斷刺五加葉適宜采收期的重要指標(biāo)，本實驗測定了刺五加的百葉干質(zhì)量,，并與多指標(biāo)成分含量測定相結(jié)合進行了綜合評價,，確定刺五加葉的最佳采收期，為刺五加葉的科學(xué)采收和合理利用提供依據(jù),。

1  材料

Waters 2695型高效液相色譜儀（美國Waters有限公司2998 PDA檢測器）,；KM-822C超聲波清洗器（廣州市科潔盟實驗儀器有限公司）；Mettler Toledo電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）,；H1650臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）,；BGZ-30電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。

對照品L-苯丙氨酸（批號J04J7R8481）,、原兒茶酸（批號Z30M6L1）,、紫丁香苷（批號P14J7F8937）、綠原酸（批號Y24J7K16726）,、咖啡酸（批號Y17D6C7672）,、蘆丁（批號Y06J8S37439）,、金絲桃苷（批號Y04A9X62302）,、槲皮素（批號C20J6Y1722），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%,，均購自上海源葉生物科技有限公司,；HPLC流動相乙腈為色譜純（J&K Scientific Ltd.公司）；水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）,；其余試劑均為分析純,。

刺五加葉樣品采自黑龍江省哈爾市黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，分別于2018年6月3日（S1）,、2018年7月3日（S2）,、2018年8月3日（S3）,、2018年9月3日（S4）、2018年10月3日（S5）進行取樣,，為保證樣本的代表性,，對10棵同一年限的固定刺五加植株進行隨機等量取樣、均勻混合,。所有樣品均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)王振月教授鑒定為五加科植物刺五加Acanthopanax seuticosus(Rupr. et Maxim.) Harms的葉,。6月份生長旺盛階段，葉片數(shù)不斷增加,，7月份進入生殖生長階段,，葉片數(shù)不斷增加。8月末9月初葉片數(shù)量不斷減少,，10月份葉片泛黃脫落,。

2  方法

2.1  刺五加葉干質(zhì)量測定

將不同時期的刺五加葉樣品分別烘干至恒定質(zhì)量，每個時期分別隨機選取刺五加葉100片,，重復(fù)3次,，用電子天平測定質(zhì)量。

2.2  色譜條件

采用Welchrom C₁₈色譜柱（250 mm×4.6 mm,，5 μm）,，以乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B）；流動相梯度洗脫,，洗脫程序：0～40 min,，10%～36.7%A，進樣體積20 μL,；體積流量1 mL/min,；檢測波長206 nm；柱溫30 ℃,；在上述條件下,，8種成分與其他相鄰峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以各成分色譜峰計均高于3 000,。色譜圖見圖1,。

2.3  溶液制備

2.3.1  對照品溶液制備  精密稱取L-苯丙氨酸、原兒茶酸,、紫丁香苷,、綠原酸、咖啡酸,、蘆丁、金絲桃苷,、槲皮素對照品適量,，加甲醇溶解,，配成質(zhì)量濃度分別為0.213、0.623,、1.025,、1.015、0.214,、5.239,、5.205、0.211 mg/mL的對照品溶液,，備用,。

2.3.2  供試品溶液制備  精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的樣品粉末（過60目篩）1.0 g，置于10 mL量瓶中,，加入10 mL甲醇,，稱定質(zhì)量，室溫下,，超聲功率480W,，超聲提取60 min（每30分鐘停止15 min）后取出，放冷用甲醇補足減失質(zhì)量,，搖勻,，置于10 mL離心管中4 000 r/min離心10 min，吸取上層清液過0.22 μm微孔濾膜,，即得,。

2.4  線性關(guān)系考察

2.5  方法學(xué)考察

2.5.1  精密度試驗  取對照品溶液適量，在“2.2”項色譜條件下,，連續(xù)進樣6次,，測得L-苯丙氨酸、原兒茶酸,、紫丁香苷,、綠原酸、咖啡酸,、蘆丁,、金絲桃苷、槲皮素峰面積RSD分別為1.69%,、1.78%,、0.58%、0.79%,、1.22%,、0.98%、1.04%、0.86%,。

2.5.2  重復(fù)性試驗  取S1樣品6份,，每份各1 g，分別制備成供試品溶液,，按照“2.2”項下色譜條件進行含量測定,，測得樣品中各成分RSD分別為1.01%、0.67%,、0.85%,、1.12%、1.26%,、1.05%,、1.37%、1.56%,，表明該方法重復(fù)性好,。

2.5.3  穩(wěn)定性試驗  取同一供試品溶液，室溫下0,、6,、8、10,、12 h分別進樣,，按照“2.2”項下色譜條件進樣各成分的峰面積RSD分別為0.65%、0.88%,、1.02%,、0.89%、1.62%,、1.44%,、2.01%、0.83%,，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定,。

2.5.4  加樣回收率試驗  精密吸取已知含量的提取液2 mL，加入適量對照品溶液,，加入甲醇定容到5 mL,，平行制樣6份，按“2.2”項下色譜條件進行分析,，每份溶液進樣平行測定3次,，計算回收率。8種成分的平均加樣回收率在99.89%～100.24%,，其RSD在1.25%～2.35%,，表明此方法準(zhǔn)確性良好,，符合試驗要求。

2.6  樣品含量測定

5批樣品,，每批3份,，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下測定,，根據(jù)相應(yīng)已知的標(biāo)準(zhǔn)方程計算其樣品含量。

2.7  數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計和主成分分析等采用Excel 2007及SPSS21.0軟件完成,。

3  結(jié)果與分析

3.1  不同時期刺五加百葉干質(zhì)量動態(tài)變化

經(jīng)測定,，不同時期刺五加百葉干質(zhì)量動態(tài)變化情況如圖2所示。

由圖2可知,，刺五加百葉干質(zhì)量在S1～S5生長季節(jié)里呈不斷增長趨勢,，在S1～S2期迅速增長，S2～S3期增長減緩,，S3期之后緩慢增長,，S5期刺五加百葉干質(zhì)量達到最大值。

3.2  刺五加葉8種成分含量動態(tài)變化

按照“2.6”項下的方法測定不同時期刺五加葉中8種成分的含量,，變化趨勢見圖3,、4。

于同一地點不同時期采收刺五加葉,，8種成分含量積累變化有差異,，其中L-苯丙氨酸和槲皮素含量波動變化較小，原兒茶酸,、紫丁香苷,、綠原酸、咖啡酸,、蘆丁,、金絲桃苷含量變化波動較大。結(jié)合圖2,、3進行詳細分析,，在S1時，除原兒茶酸達到監(jiān)測全程的含量積累最大值0.502 7 mg/g外,，其他5種成分含量均處于較低水平,，但在S1～S2期間，這5種成分都處于積累升高狀態(tài),。在S2時,，除原兒茶酸含量積累有所下降外，紫丁香苷,、綠原酸,、咖啡酸,、蘆丁、金絲桃苷這5種成分含量均達到監(jiān)測全程的最大值,，分別0.649 0,、6.376 4、1.137 9,、42.635 7,、46.7334 mg/g。在S3至S5期間,，8種0.066 4,、0.048 9 mg/g。

3.3  不同時期每百片刺五加葉中8種有效成分積累總量變化趨勢

    從圖5可知,，不同時期刺五加葉8種成分積累總量（有效成分積累總量＝有效成分總量×百葉質(zhì)量）整體呈先上升后下降的變化規(guī)律,。即在S1～S2期間總量總體呈上升趨勢，到S2時達到最大,，為1.615 g,，S2～S3期間總量急劇下降，S3～S5之后隨著采收時間的推遲,，有效成分積累總量（每百葉）呈明顯下降趨勢,。

3.4  基于主成分分析的不同時期刺五加葉的綜合評價

主成分分析，是考察多個變量間相關(guān)性的一種多元統(tǒng)計方法,，通過原始變量中導(dǎo)出少數(shù)幾個主成分,，使它們盡可能多的保留原始變量的信息，且彼此間互不相關(guān),，將多個具有相關(guān)性指標(biāo)轉(zhuǎn)換成少數(shù)幾個互相獨立的綜合指標(biāo)（即主成分）,，通過將各指標(biāo)得分與其權(quán)重結(jié)合進行綜合評分^[21-22]。

由表2可知,，特征值大于1的有2個主成分,，兩者方差累積率為92.24%＞80%，能夠客觀反映刺五加葉藥材的內(nèi)在質(zhì)量,，故選取F₁,、F₂進行分析。根據(jù)特征向量,，計算刺五加樣品各自主成分得分,，由此可以得到主成分線性組合表達式，F＝0.817 5F₁＋0.182 5 F₂,，其中F為綜合得分,，F₁為第1主成分，F₂為第2主成分,。由主成分綜合評價表達式,，可以計算出不同時期刺五加葉綜合評價得分并排序,，結(jié)果見表3，綜合得分值值越高,，綜合品質(zhì)越好,。再將8種成分積累總量與主成分綜合評價得分結(jié)合做圖，結(jié)果見圖6,，由此來確定最適宜采收期,。

根據(jù)表3綜合評價排序可以看出，刺五加葉在S2（7月3日）時采收樣品F值最高,，并與直觀折線圖分析結(jié)果一致,。并由圖6可知，在考慮L-苯丙氨酸,、原兒茶酸、紫丁香苷,、綠原酸,、咖啡酸、蘆丁,、金絲桃苷,、槲皮素這8種成分積累總量時，S1～S2期間（6月下旬～7月份上旬）為刺五加葉最適宜采收期,。

4  討論

預(yù)試驗對提取溶劑（體積分?jǐn)?shù)為50%,、75%、100%甲醇）,、提取時間（30,、40、60 min）進行了考察,，結(jié)果表明,，100%甲醇為最適宜提取刺五加葉的溶劑，60 min為最佳提取時間,，但為了防止超聲時間過長產(chǎn)熱,，對提取效果有影響，每提取30min時,，會停止15 min,。因此選擇100%甲醇提取60 min （每30分鐘停止15 min）。

此實驗首次采用HPLC對刺五加葉中L-苯丙氨酸,、原兒茶酸,、紫丁香苷、綠原酸,、咖啡酸,、蘆丁,、金絲桃苷和槲皮素的含量進行了測定，建立方法初期,，首先采用甲醇-水與乙腈-水,，分別作為流動相，結(jié)果表明分離效果均不好,，并且難以達到基線分

等度洗脫時,，其他成分相互有干擾，而采用梯度洗脫時,，各有效色譜峰和分離效果良好,。同時，檢測時為保證8種指標(biāo)成分都具有較高的靈敏度,，能夠準(zhǔn)確測定各成分含量,，采用全波長掃描，發(fā)現(xiàn)在206 mm處,，均具有較大的吸收值,。

以往研究對刺五加葉采收期的研究都以單一化學(xué)成分或單一類成分作為考察指標(biāo)，難以客觀,、科學(xué)地反映其內(nèi)在質(zhì)量,，而本次研究首次以刺五加葉中8種有效成分作為考察指標(biāo)，采用主成分分析法對不同采收期刺五加葉中8種有效成分含量進行了綜合評價,，并將8種有效成分積累量與葉片干質(zhì)量結(jié)合分析,，結(jié)果更加科學(xué)合理，為刺五加葉適宜采收期提供數(shù)據(jù)支持,，同時也為刺五加葉內(nèi)在質(zhì)量綜合評價體系的建立提供參考,。

對比張爽等^[26]對不同時期刺五加莖中有效成分積累量的動態(tài)變化研究發(fā)現(xiàn)，在6月初,，莖,、葉共有的有效成分均處較低的水平。在7月初,，刺五加莖,、葉中有效成分積累量均呈上升趨勢，且刺五加葉中的有效成分的積累量達到了最高水平,。在8月之后刺五加莖中的有效成分積累量呈穩(wěn)定升高的趨勢,，而刺五加葉中有效成分積累量均呈明顯下降趨勢，其可能與刺五加的養(yǎng)分傳輸具有節(jié)律性有關(guān),，所以確定刺五加葉的適宜采收期對于整個植株的研究具有重要的意義,。特別是對于刺五加這種瀕危物種，自然資源極為有限,，制約該種群可持續(xù)自然更新的因素又很多,，如何保持最大生物利用度的利用刺五加資源具有深遠的研究價值,。

參考文獻（略） 

來  源：李俊萍，付士朋,，王謙博,，王  聰，趙天琪,，王振月. 多指標(biāo)綜合評價刺五加葉適宜采收期的研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(13):3187-3192.