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第三節(jié) 菌種分離 菌種分離即是進行蘑菇菌絲的純化過程,，它是制種工作的重要環(huán)節(jié),，通俗講是把蘑菇菌絲從自然界中單獨分離出來進行純培養(yǎng)，從而獲得純蘑菇菌絲生長的菌種,。蘑菇菌種的分離方法有三種：即孢子分離,、組織分離和基質(zhì)菌絲分離法。 一,、孢子分離法 蘑菇孢子分離法,，是利用成熟子實體的有性擔孢子能自動從子實體層中彈射出來的特征，在無菌條件下和適宜的培養(yǎng)基上,，使孢子萌發(fā)成菌絲,，獲得純種的一種方法。孢子分離可分為單孢分離和多孢分離法兩種,，由于是從有性擔孢子（是指其細胞核已經(jīng)地核配過程）分離純菌絲體,，因此生產(chǎn)上多采用多孢分離法來保持菌株的原有特性，而單孢分離法主要應用于菌株的篩選和雜交育種等工作，孢子分離主要分為兩個步驟,，首先是采集孢子,，其次進行單孢或多孢子分離。 （一）采集孢子 １,、種菇的選擇 采集孢子首先要選好種菇即分離用的子實體,。一般蘑菇種菇要求是第一潮菇，出菇較早,，單生,，個體健壯，特征典型的子實體,，經(jīng)過仔細的觀察篩選后在菇床上做個記號,，讓種菇充分生長，直至即將破膜時將菇采摘進行孢子彈射,。 ２,、孢子彈射收集 種菇采收后可浸入0.1%升汞溶液中消毒約一分鐘，用鑷子取出后經(jīng)無菌水沖洗數(shù)次,，再用無菌濾紙把表面水吸干,，或直接用75% 酒精棉球輕輕控拭菌蓋及菌柄進行表面消毒。隨后用無菌刀切掉多余菌柄（約留下1.5-2cm即可）,，把菇直立,，菇柄朝下插入鋁線制作的支持物上，放入了先準備好鋪有無菌濾紙條的平皿上,，蓋上鐘罩（如圖 所示）,。這套孢子收集裝置需事先進行高壓滅菌消毒。把裝好子實體的孢子彈射收集器放在溫度為15-20℃的室內(nèi),經(jīng)24-48小時左右,，可見到無菌濾紙上有褐色的蘑菇孢子印,。在無菌操作下把收集到蘑菇孢子的濾紙條裝入無菌的空試管中，并在溫度下進行真空干燥,，之后放入冰箱可長期保存?zhèn)溆谩?SPAN lang=EN-US> （二）孢子分離 １,、多孢分離法 即把多個孢接種在同一培養(yǎng)基上，讓它們萌發(fā)共同生長交錯在一起,，從而獲得純種的一種方法,，由于多個孢子間的種性互補，基本上可以保持親本的穩(wěn)定性,，此法比較簡易,，在過去的蘑菇制種中應用較為普遍。 （１）斜面劃線法：按無菌操作規(guī)程,，用無菌接種環(huán)從收到孢子的濾紙條上沾取少量孢子,，在PDA試管斜面培養(yǎng)基上自下而上劃線,，劃線時勿用力，以免劃破培養(yǎng)基表面,，接種完畢,，抽出接種種灼燒試管口，塞上棉塞,，放置24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，待孢子萌發(fā)后（一般約15-20天），挑選萌發(fā)快,，長勢旺的菌落,， 轉(zhuǎn)接于新試管培養(yǎng)基上再行培養(yǎng)。 （２）涂布分離法：按無菌操作方法,，取一小塊具有孢子的濾紙條,，放入裝有無菌水的小三角瓶中，充分搖勻制成孢子懸浮液,，然后用已滅菌的試管,，吸取孢子懸浮液，滴1-2滴到PDA試管或培養(yǎng)皿培養(yǎng)基上,，轉(zhuǎn)動試管使孢子懸浮液均勻分布于斜面上,，或用玻璃涂布棒將平板上的懸浮液涂布均勻。孢子在培養(yǎng)基上經(jīng)24℃恒溫培養(yǎng)萌發(fā)后,，挑選幾株發(fā)育勻稱,，生長速度快的菌落，移接于另一試管斜面培養(yǎng)基上,，恒溫培養(yǎng)即為母種,。 ２,、單孢分離 就是將采集到的孢子群單個分開進行培養(yǎng),，讓它單獨萌發(fā)成菌絲而獲得純種的方法，單孢子分離的方法,，按分離的手段可分為以下三種,。 （１）稀釋分離法：這是通過不斷稀釋孢子懸浮液，使孢子分散最終孢子濃度控制在300-500個孢子/毫升,吸取0.1毫升的孢子液注入平板均勻涂布,，分散孢子各自萌發(fā)形成單孢菌落,，其步驟如下： ①制備無菌水試管:取10支試管,其中1支裝100毫升蒸餾水,其它9支裝9毫升蒸餾水,經(jīng)高壓滅菌即成無菌水。 ②制孢子懸液：取一小塊收集有孢子的濾紙條,，浸入10毫升無菌水試管中, 搖振使孢子分散成懸液,用無菌1毫升移液管吸取1毫升孢子懸液于第2支試管中, 搖振使其分期,再從第2支試管中吸取1毫升注入第3支試管中, 如此反復稀釋直到孢子濃度達到300-500個孢子/毫升,備用,。 ③制培養(yǎng)基平板：配制PDA培養(yǎng)基,裝入三角瓶中進行高壓滅菌, 準備倒平板的培養(yǎng)皿也經(jīng)過高壓滅菌備用,待已滅菌的PDA冷卻至50-60℃時,在無菌操作下倒15-20 毫升PDA至培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)皿放平,晝使培養(yǎng)基表面光滑,厚度一致。 ④孢子涂布：在無菌操作下,，吸取0.1毫升的孢子懸浮液滴在平板培養(yǎng)基表面上,使用T氏棒把孢子均勻涂布在平板上,蓋上刺激菌絲培養(yǎng)皿,放置于24-25℃恒溫箱中培養(yǎng),。 ⑤挑選單孢子萌發(fā)菌落：一般孢子經(jīng)過５天的培養(yǎng)開始萌發(fā)長出菌絲,，培養(yǎng)皿經(jīng)過顯微鏡的鏡檢確定孢子萌發(fā)的菌落是由單個孢子萌發(fā)成長而成的，可使用打孔器進行打孔把該菌落移接至新鮮的PDA斜面試管中繼續(xù)培養(yǎng),。 打孔器的外徑應小于顯微鏡的視野范圍,，而且打孔之前須檢查該菌落周圍是否有孢子或其它菌落，晝使打孔不會觸及周邊的孢子或菌落,，確保純種,。 （２）毛細管法：孢子懸浮液經(jīng)過稀釋，使用毛細滴管把孢子懸浮液滴一小滴于皿蓋內(nèi),，晝使每一滴只含有一個孢子,，從而達到單孢子分離，其方法如下： ①孢子懸浮液制備同稀釋分離法,，孢子濃度控制在200-300個孢子/毫升,。 ②毛細滴管制備:取潔凈的玻璃管在酒精噴燈上先拉成外徑1毫米的細管, 稍冷卻后再加熱并迅速拉長,使管尖內(nèi)徑約200微米,剪斷即成毛細滴管,在滴管后端塞棉花, 裝入消毒盒中后進行滅菌備用。 ③點樣鏡檢：用毛細滴管吸取經(jīng)稀釋的孢子懸浮液約0.1毫升(可滴30滴),在無菌操作下,快速點于皿蓋內(nèi)壁的標記圈中央,滴液應小于低倍鏡的視野, 點樣后的培養(yǎng)皿仍蓋在有水瓊脂的皿底上,貼膠布固定后再用低倍銳檢查皿蓋內(nèi)壁的的液滴,確定是單孢者,即在皿蓋上標上記號,。 ④培養(yǎng)基推貼及刺激培養(yǎng)：使用接種針取一小塊PDA培養(yǎng)基(約2×2毫米方塊) 推貼至標記為單孢子的液滴,使液滴中的孢子能夠吸附到培養(yǎng)基邊緣,。 將事先培養(yǎng)好蘑菇氣生菌絲的平板培養(yǎng)皿蓋取下，套在菌絲平板的底部,，再把已分離并推貼好的培養(yǎng)基的皿蓋罩在套有菌絲平板的玻璃皿上,，使兩個皿蓋對接，貼膠布封口(要留0.5厘米縫用作通氣),這樣就形成一個刺激單孢子萌發(fā)的培養(yǎng)室,置培養(yǎng)箱中24 ℃下培養(yǎng),待單孢子萌發(fā),及時撕下膠布,用接種鏟挑取已萌發(fā)的單孢菌絲貼塊,移接到新鮮PDA斜面試管中,置24℃恒溫箱中培養(yǎng),即可區(qū)得單孢純種,。 （３）器械分離法：應用顯微操作器,，直接挑選單孢子，移至PDA 平板中進行孢子刺激萌發(fā)培養(yǎng),獲得單孢純種,。 ①孢子懸浮液制備：同稀釋分離法,，孢子濃度控制在1000個/毫升; ②平板涂布:將稀釋后的孢子懸浮液滴0.1毫升于平板上,用無菌的T氏棒進行均勻涂布,每個平板含孢子大約100個左右; ③鏡檢分離:待涂布均勻的平板瓊脂表面水分干燥后即可于顯微鏡下觀察,當在視野中心見到孢子,而視野周圍無其它孢子時,可用顯微操作器操縱玻璃針把孢子從培養(yǎng)基表面挑取,隨后把孢子轉(zhuǎn)移至PDA平板的表面上,進行孢子萌發(fā)培養(yǎng),孢子萌發(fā)培養(yǎng)須使用蘑菇氣生菌絲刺激培養(yǎng),才能提高萌發(fā)率,培養(yǎng)的具體操作方法與涂布分離法相同。 （４）單孢子菌落接待：當孢子經(jīng)過10天的刺激培養(yǎng), 肉眼可見到菌絲生長而成小菌落,應及時用打孢子器把該菌落分離,每天都應觀察孢子萌發(fā)情況, 如果不及時把菌落移接,該菌落會快速生長而影響較遲萌發(fā)單孢子的分離,。 二,、組織分離法 組織分離法是利用子實體組織來分離獲得純菌絲的方法。組織分離系一種無性繁殖法,，雙親的染色體沒有經(jīng)過重組,，因此組織分離基本上可保持親本的生物不特性，棒操作簡便,，取村廣泛,，在過去傳統(tǒng)的穩(wěn)定菌株中常采用此方法進行菌種的分離，退化不明顯,，但是隨著蘑菇雜交菌種的應用,，由于雜種本身所具有的不穩(wěn)定，組織分離常造成菌株的退化,，目前生產(chǎn)上很少采用,，只是進行野生菌株分離時,，才比較常用。其方法如下： ①挑選種菇：其標準與孢子收集要求相同,； ②菇體消毒：將子實體菌柄基部切除,置接種箱內(nèi),用75%酒精對菇體表面進行消毒; ③組織分離:解剖刀經(jīng)火焰滅菌,在菇柄中部縱切一刀, 用手掰開菌再用接種鏟在菇蓋與菇柄交界處切五個小方塊,隨后挑取一小塊組織,迅速移接到PDA斜面培養(yǎng)基上,置24℃下培養(yǎng),待組織塊長出菌絲無污染即為純種,。 |
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