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33 實(shí)驗(yàn)十三 化妝品中銅綠假單胞菌檢測(cè) 銅綠假單胞菌也稱綠膿桿菌,，屬于假單胞菌屬，在自然界廣泛分布,，對(duì)外環(huán) 境的抵抗力較強(qiáng),，為條件致病菌，可引起人的眼,、耳,、鼻、咽喉和皮膚等處感染,， 特別是燒傷,、燙傷后的感染尤為嚴(yán)重，常使病情惡化,，并可引起敗血癥,。該菌為 革蘭陰性桿菌，氧化酶陽性,，能產(chǎn)生綠膿菌索為其特征,。此外還能液化明膠，還 原硝酸鹽為亞硝酸鹽,，在42℃條件下能生長,，可與類似菌區(qū)別。 【目的意義】 1．掌握銅綠假單胞菌檢測(cè)的主要步驟與方法,。 2．熟悉化妝品標(biāo)本的采集原則,。、 3．掌握銅綠假單胞菌落的觀察和生化反應(yīng)結(jié)果的判斷,。 【實(shí)習(xí)時(shí)數(shù)】 3學(xué)時(shí),。 【儀器設(shè)備和試劑】 1．培養(yǎng)基SCDLP液體培養(yǎng)基、十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基,、乙酰胺培 養(yǎng)基,、綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基,、明膠培養(yǎng)基、硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基,、普通瓊脂 斜面培養(yǎng)基,。 2．儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱，高壓滅菌器,，滅菌平皿,，滅菌刻度吸管，接種環(huán),， 接種針,，酒精燈，廣口瓶,，三角燒瓶等,。 【操作步驟、觀察與記錄要求】 (一)檢驗(yàn)程序 34 (二)檢驗(yàn)方法 1．樣品的前處理 (1)親水性樣品(水包油型)：可取10g加到90ml帶玻璃珠的滅菌生理鹽水中,， 如樣品量少于10ml,，仍按10倍稀釋法進(jìn)行。如為5ml則加45ml滅菌生理鹽水,， 混勻后,，制成1：10稀釋液。 (2)疏水性樣品(油包水型)：取樣品10g先加10ml滅菌液狀石蠟混勻,，再加 10ml滅菌的吐溫80,，在40～44℃水中振蕩混合10min，加入滅菌生理鹽水75ml,， 在40～44℃水浴中乳化,，制成1：10懸液?；蛴镁|(zhì)器,，將加有助溶劑、稀釋 液的樣品放入均質(zhì)器,，均質(zhì)3～5min后,，取上清液待檢(上清液的稀釋倍數(shù)為1： 10),。 (3)膏,、霜、乳劑半固體狀樣品 1)親水性的樣品稱取10g,，加到滅菌的90ml生理鹽水的錐形瓶(內(nèi)帶玻璃珠) 中,，充分振蕩混勻，放30～32℃水浴中靜置15min,，用其上清液作為1：lO的稀 釋液,。 2)疏水性的樣品稱取10g,，放到滅菌的研缽中，加10ml滅菌液狀石蠟,，研 磨成黏稠狀,，再加10ml滅菌吐溫80，研磨待溶解后,，加70ml滅菌生理鹽水,， 在40～44℃水浴中充分混合，制成1：10稀釋液,。 (4)固體樣品：稱取10g,，加到滅菌的90ml生理鹽水稀釋瓶中，振蕩混勻,， 35 使其分散混懸后,，放30～32℃水浴中，15min后取出,，充分振蕩混合,，再放到 30～32℃水浴中靜置15min，取上清液作為1：10稀釋液,。如有均質(zhì)器,，上述親 水性膏、霜,、乳劑等,，可稱10g樣品加90ml滅菌生理鹽水，均質(zhì)1～2min;疏水 性膏,、霜及眉筆,、口紅等，稱10g樣品加90ml SCDLP液體培養(yǎng)基,，或1g樣品 加lml滅菌液狀石蠟,、lml滅菌吐溫80、7ml滅菌生理鹽水,，均質(zhì)3～5min,。 2．增菌培養(yǎng) 取1：10稀釋樣品10ml加入90ml
SCDLP液體培養(yǎng)基中，置 37℃培養(yǎng)18～24h,，進(jìn)行增菌,。如有銅綠假單胞菌生長，則培養(yǎng)基表面有一薄層 菌膜,，培養(yǎng)液呈黃綠色或藍(lán)綠色,。 3．分離培養(yǎng) 從增菌培養(yǎng)液的菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷三甲 基溴化銨瓊脂平板上,，置37℃培養(yǎng)18～24h,，進(jìn)行分離培養(yǎng),。此培養(yǎng)基具有較強(qiáng) 的選擇性，大腸埃希菌不能生長,，革蘭陽性菌生長較差,，而銅綠假單胞菌則生長 成扁平菌落，向周邊擴(kuò)散或略有蔓延,，表面濕潤,，邊緣不整，菌落呈灰白色,，菌 落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素,。也可用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，37℃培 養(yǎng)24h,，銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上生長良好,，菌落扁平，邊緣不整齊,，菌落周 圍培養(yǎng)基略帶粉紅色,，其他菌不生長。 4．染色鏡檢 挑取可疑菌落,，涂片,，革蘭染色，鏡檢為革蘭陰性桿菌者應(yīng) 進(jìn)行氧化酶試驗(yàn),。 5．氧化酶試驗(yàn) 取一小塊潔凈白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi),，用無菌玻璃棒挑 取銅綠假單胞菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上加1滴新配制的1％二甲基 對(duì)苯二胺試劑,，在15～30s之內(nèi),，出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時(shí)，為氧化酶試驗(yàn)陽性,； 若培養(yǎng)物不變色,，則為氧化酶試驗(yàn)陰性。少數(shù)其他菌可能也有顏色反應(yīng),，但反應(yīng) 出現(xiàn)較晚,。氧化酶試驗(yàn)陽性者，進(jìn)一步做綠膿菌素實(shí)驗(yàn),。 6．綠膿菌素試驗(yàn) 取可疑菌落2～3個(gè),，分別接種在綠膿菌素培養(yǎng)基上，置 37℃培養(yǎng)24h,，加入氯仿3～5ml,，充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液 中,；當(dāng)氯仿提取液呈藍(lán)色時(shí),，用吸管將氯仿移至另一試管中并加入lmol／L的鹽 酸lml左右,，振蕩后靜止片刻，如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時(shí)為陽性,， 表示被檢物中有綠膿菌素存在,。如綠膿菌素試驗(yàn)陰性則還要做下面三個(gè)試驗(yàn),。 7.硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn) 挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種于硝酸鹽 蛋白胨水培養(yǎng)基中,，置37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果,。凡在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基中 36 的小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生者，即為陽性,，表明該菌可還原硝酸鹽，并將硝酸鹽分解 產(chǎn)生氮?dú)狻?span lang="EN-US"> 8.明膠液化試驗(yàn) 取銅綠假單胞菌可疑純培養(yǎng)物,，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基 內(nèi)，置37℃培養(yǎng)24h,，取出放冰箱10～30min，如仍呈溶解狀即為明膠液化試驗(yàn) 陽性,，如凝固不溶鏘者為陰性,。 9.42℃生長試驗(yàn) 挑取純培養(yǎng)物,，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，放41～42 ℃培養(yǎng)箱中,，培養(yǎng)24～48h。銅綠假單胞菌能生長,，為陽性，而近似的熒光假單 胞菌則不能生長,。 【檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告】 被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后,，在分離平板上有典型或可疑菌落生長，經(jīng)證實(shí) 為革蘭陰性桿菌,，氧化酶及綠膿菌素試驗(yàn)皆為陽性者,，可報(bào)告被檢樣品中檢出有 銅綠假單胞菌。如綠膿菌素試驗(yàn)陰性,，而液化明膠,、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42℃生 長試驗(yàn)三者皆為陽性時(shí)，仍可報(bào)告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌,。 【問題與思考題】 1．化妝品微生物檢驗(yàn)樣品的采集原則是什么? 2．化妝品微生物檢驗(yàn)的特點(diǎn)是什么? 3．如何證實(shí)化妝品被銅綠假單胞菌污染? 4．化妝品特定菌的概念,，種類及其衛(wèi)生學(xué)意義。 銅綠假單胞菌在化妝品中指綠膿桿菌,，該菌對(duì)人有致病力,，可使傷處化膿，引起敗血癥等,。檢測(cè)方法是《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》下面是詳細(xì)的檢測(cè)方法： |
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