第三節(jié) 工業(yè)微生物菌種的選育

　　用發(fā)酵法生產(chǎn)產(chǎn)品,，首先要有一個(gè)良好的菌種。因此必須進(jìn)行菌種選育工作,。菌種選育工作大幅度提高了微生物發(fā)酵的產(chǎn)量,，促進(jìn)了微生物發(fā)酵工業(yè)的迅速發(fā)展。通過(guò)菌種選育,，抗生素,、氨基酸、維生素,、藥用酶等產(chǎn)物的發(fā)酵產(chǎn)量提高了幾十倍,、幾百倍、甚至幾千倍,。菌種選育在提高產(chǎn)品質(zhì)量,、增加品種、改善工藝條件和生產(chǎn)菌的遺傳學(xué)研究等方面也發(fā)揮重大作用,。菌種選育的目的是改良菌種的特性,，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。
　　菌種選育包括經(jīng)驗(yàn)育種和定向育種,，其中經(jīng)驗(yàn)育種又分自然選育和誘變育種,。在生產(chǎn)過(guò)程中，不經(jīng)過(guò)人工誘變處理,，根據(jù)菌種的自發(fā)突變（亦稱自然突變）而進(jìn)行菌種篩選的過(guò)程,，叫做自然選育。由于野生菌株生產(chǎn)能力低,，往往不能滿足工業(yè)上的需要,。因?yàn)樵谡Ｉ項(xiàng)l件下，微生物依靠其代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng),，趨向于快速生長(zhǎng)和繁殖,。但是，發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn),，需要培養(yǎng)微生物使之積累大量的代謝產(chǎn)物,。為此，采用種種措施來(lái)打破菌的正常代謝,，對(duì)代謝流進(jìn)行調(diào)節(jié)控制,，從而大量積累我們所需要的代謝產(chǎn)物。例如青霉素的原始生產(chǎn)菌種產(chǎn)生黃色色素,，使成品帶黃色,，經(jīng)過(guò)菌種選育,，生產(chǎn)菌不再分泌黃色色素；土霉素產(chǎn)生菌在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生大量泡沫,，經(jīng)誘變處理后改變了遺傳特性,，發(fā)酵泡沫減少，可節(jié)省大量消泡劑并增加培養(yǎng)液的裝量,；紅霉素等品種發(fā)酵遇有噬菌體侵襲時(shí),，發(fā)酵產(chǎn)量大幅度下降，甚至被迫停產(chǎn),，菌種經(jīng)誘變處理獲得抗噬菌體的特性,，就可保證發(fā)酵生產(chǎn)的正常進(jìn)行,。

　　自然選育包括從自然界分離獲得菌株和根據(jù)菌種的自發(fā)突變進(jìn)行篩選而獲得菌種,。
⒈ 從自然界分離獲得菌株
　　從自然界分離新菌種一般包括以下幾個(gè)步驟：采樣、增殖培養(yǎng),、純種分離和性能測(cè)定等,。
　　⑴ 采樣　采樣地點(diǎn)的確定要根據(jù)篩選的目的,、微生物的分布概況及菌種的主要特征與外界環(huán)境關(guān)系等,，進(jìn)行綜合、具體地分析來(lái)決定,。如果預(yù)先不了解某種生產(chǎn)菌的具體來(lái)源,，一般可從土壤中分離。采樣的方法多是在選好地點(diǎn)后,，用小鏟去除表土,，取離地面5～15 cm處的土壤幾十克，盛入預(yù)先消毒好的牛皮紙袋或塑料袋中,，扎好,，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn),、環(huán)境情況等,，以備考查。一般土壤中芽孢桿菌,、放線菌和霉菌的孢子忍耐不良環(huán)境的能力較強(qiáng),，不太容易死亡。但是,，由于采樣后的環(huán)境條件與天然條件有著不同程度的差異,，一般應(yīng)盡快分離。對(duì)于酵母類或霉菌類微生物,，由于它們對(duì)碳水化合物的需要量比較多,，一般又喜歡偏酸性環(huán)境,，所以酵母類、霉菌類在植物花朵,、瓜果種子及腐殖質(zhì)含量高的土壤等上面比較多,。
　　⑵ 增殖培養(yǎng)　收集到的樣品,，如含目標(biāo)菌株較多,，可直接進(jìn)行分離。如果樣品含目標(biāo)菌種很少,，就要設(shè)法增加該菌的數(shù)量,，進(jìn)行增殖(富集)培養(yǎng)。所謂增殖培養(yǎng)就是給混合菌群提供一些有利于所需菌株生長(zhǎng)或不利于其它菌型生長(zhǎng)的條件,，以促使目標(biāo)菌株大量繁殖,，從而有利于分離它們。例如篩選纖維素酶產(chǎn)生菌時(shí),，以纖維素作為唯一碳源進(jìn)行增殖培養(yǎng),，使得不能分解纖維素的菌不能生長(zhǎng)；篩選脂肪酶產(chǎn)生菌時(shí),，以植物油作為唯一碳源進(jìn)行增殖培養(yǎng),，能更快更準(zhǔn)確地將脂肪酶產(chǎn)生菌分離出來(lái)。除碳源外,，微生物對(duì)氮源,、維生素及金屬離子的要求也是不同的，適當(dāng)?shù)乜刂七@些營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)提高分離效果是有好處的,。另外,，控制增殖培養(yǎng)基的pH值，有利于排除不需要的,、對(duì)酸堿敏感的微生物,；添加一些專一性的抑制劑，可提高分離效率,，例如在分離放線菌時(shí),，可先在土壤樣品懸液中加10％的酚液數(shù)滴，以抑制霉菌和細(xì)菌的生長(zhǎng),；適當(dāng)控制增殖培養(yǎng)的溫度,，也是提高分離效率的一條好途徑。
　?、?純種分離　通過(guò)增殖培養(yǎng)還不能得到微生物的純種,，因?yàn)樯a(chǎn)菌在自然條件下通常是與各種菌混雜在一起的，所以有必要進(jìn)行分離純化，才能獲得純種,。純種分離方法常選用單菌落分離法,。把菌種制備成單孢子或單細(xì)胞懸浮液，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)南♂尯?，在瓊脂平板上進(jìn)行劃線分離,。劃線法是將含菌樣品在固體培養(yǎng)基表面作有規(guī)則的劃線(有扇形劃線法、方格劃線法及平行劃線法等),，菌樣經(jīng)過(guò)多次從點(diǎn)到線的稀釋,，最后經(jīng)培養(yǎng)得到單菌落。也可以采用稀釋法,，該法是通過(guò)不斷地稀釋,，使被分離的樣品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板,，使每一微生物都遠(yuǎn)離其他微生物而單獨(dú)生長(zhǎng)成為菌落,，從而得到純種。劃線法簡(jiǎn)單且較快,，稀釋法在培養(yǎng)基上分離的菌落單一均勻,，獲得純種的概率大,，特別適宜于分離具有蔓延性的微生物,。采用單菌落分離法有時(shí)會(huì)夾雜一些由兩個(gè)或多個(gè)孢子所生長(zhǎng)的菌落，另外不同孢子的芽管間發(fā)生吻合,，也可形成異核菌落,。要克服這些缺點(diǎn)，就要特別重視單孢子懸浮液的制備方法,。為使單孢子懸浮液有良好的分散度,，力求去除菌絲斷片或粘接在一起的成串的孢子，可采用如下方法制備單孢子懸浮液：① 對(duì)于細(xì)菌,，因其在固體斜面培養(yǎng)基上常粘在一起,，故要求轉(zhuǎn)種到新鮮肉湯液體中進(jìn)行培養(yǎng)，以取得分散且生長(zhǎng)活躍的菌體,；② 對(duì)放線菌和霉菌的孢子,，采用玻璃珠或石英砂振蕩打散孢子后，用濾紙或棉花過(guò)濾,；對(duì)某些黏性大的孢子,，常加入0.05％的分散劑(如吐溫80，Tween 80)以獲得分散的單個(gè)孢子,。
為了提高篩選工作效率,，在純種分離時(shí)，培養(yǎng)條件對(duì)篩選結(jié)果影響也很大,，可通過(guò)控制營(yíng)養(yǎng)成分,、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值,、添加抑制劑、改變培養(yǎng)溫度和通氣條件及熱處理等來(lái)提高篩選效率,。平板分離后挑選單個(gè)菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力測(cè)定,，從中選出優(yōu)良的菌株。
　?、?生產(chǎn)性能的測(cè)定　由于純種分離后,，得到的菌株數(shù)量非常大，如果對(duì)每一菌株都作全面或精確的性能測(cè)定,，工作量十分巨大,，而且是不必要的。一般采用兩步法,，即初篩和復(fù)篩,，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)篩選，直到獲得1～3株較好的菌株,，供發(fā)酵條件的摸索和生產(chǎn)試驗(yàn),，進(jìn)而作為育種的出發(fā)菌株。這種直接從自然界分離得到的菌株稱為野生型菌株,，以區(qū)別于用人工育種方法得到的變異菌株（亦稱突變株）,。
⒉ 從自發(fā)突變體中獲得菌株
　　一般微生物可遺傳的特性發(fā)生變化稱為變異，又稱突變,，是微生物產(chǎn)生變種的根源,，同時(shí)也是育種的基礎(chǔ)。自然突變是指在自然條件下出現(xiàn)的基因變化,。目前,，發(fā)酵工業(yè)中使用的生產(chǎn)菌種，幾乎都是經(jīng)過(guò)人工誘變處理后獲得的突變株,。這些突變株是以大量生成某種代謝產(chǎn)物(發(fā)酵產(chǎn)物)為目的篩選出來(lái)的,，因而它們屬于代謝調(diào)節(jié)失控的菌株。微生物的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)趨向于最有效地利用環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),，優(yōu)先進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖,，而生產(chǎn)菌種常常是打破了原有的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)的突變株，因此常常表現(xiàn)出生活力比野生菌株弱的特點(diǎn),。此外,，生產(chǎn)菌種是經(jīng)人工誘變處理而篩選獲得的突變株，遺傳特性往往不夠穩(wěn)定,，容易繼續(xù)發(fā)生變異,，使得生產(chǎn)菌株呈現(xiàn)出自然變異的特性，如果不及時(shí)進(jìn)行自然選育，通常會(huì)導(dǎo)致菌種性能變化,，使發(fā)酵產(chǎn)量降低,，但也有變異使菌種獲得優(yōu)良性能的情況。
　　自發(fā)突變的頻率較低,，因此自然選育篩選出來(lái)的菌種,，不能滿足育種工作的需要，不完全符合工業(yè)生產(chǎn)的要求,，如產(chǎn)量低,、副產(chǎn)物多、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等,。因而不能僅停留在“選”種上,，還要進(jìn)行“育”種。如通過(guò)誘變劑處理菌株,，就可以大大提高菌種的突變頻率,，擴(kuò)大變異幅度，從中選出具有優(yōu)良特性的變異菌株,，這種方法就稱為誘變育種,。

　　誘變育種和其他方法相比較，人工誘變能提高突變頻率和擴(kuò)大變異譜,，具有速度快,、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前菌種選育的一種主要方法,，在生產(chǎn)中使用得十分普遍,。但是誘發(fā)突變隨機(jī)性大,，因此誘發(fā)突變必須與大規(guī)模的篩選工作相配合才能收到良好的效果,。如果篩選方法得當(dāng)，也有可能定向地獲得好的變異株,。
　　誘變育種的主要環(huán)節(jié)是：① 以合適的誘變劑處理大量而均勻分散的微生物細(xì)胞懸浮液(細(xì)胞或孢子),，以引起絕大多數(shù)細(xì)胞致死的同時(shí)，使存活個(gè)體中DNA堿基變異頻率大幅度提高,；② 用合適的方法淘汰負(fù)變異株,，選出極少數(shù)性能優(yōu)良的正變異株，以達(dá)到培育優(yōu)良菌株的目的,。誘變育種的程序如圖4-1所示,。

圖4-1　誘變育種的程序
　　⒈ 出發(fā)菌株的選擇
　　工業(yè)上用來(lái)進(jìn)行誘變處理的菌株,，稱為出發(fā)菌株(parent strain),。在許多情況下，微生物的遺傳物質(zhì)具有抗誘變性，這類遺傳性質(zhì)穩(wěn)定的菌株用來(lái)生產(chǎn)是有益的,，但作為誘變育種材料是不適宜的,。出發(fā)菌株通常有三種：① 從自然界分離得到的野生型菌株；② 通過(guò)生產(chǎn)選育,，即由自發(fā)突變經(jīng)篩選得到的高產(chǎn)菌株,；③ 已經(jīng)誘變過(guò)的菌株，這類菌株作為出發(fā)菌株較為復(fù)雜,。一般認(rèn)為誘變獲得高產(chǎn)菌株,，再誘變易產(chǎn)生負(fù)突變，再度提高產(chǎn)量比較困難,。采用連續(xù)誘變的方法,，在每次誘變之后選出3～5株較好的菌株繼續(xù)誘變，如果遇到高產(chǎn)菌株再誘變進(jìn)一步提高產(chǎn)量效果不佳時(shí),，可以先行雜交,，再作為誘變的出發(fā)菌株，這樣有可能收到比較好的效果,。
　?、?菌懸液的制備
　　采用生理狀態(tài)一致(用選擇法或誘導(dǎo)法使微生物同步生長(zhǎng))的單細(xì)胞或孢子進(jìn)行誘變處理，這樣不但能均勻地接觸誘變劑,，還可減少分離現(xiàn)象的發(fā)生,。處理前細(xì)胞盡可能達(dá)到同步生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞懸液經(jīng)玻璃珠振蕩打散,，并用脫脂棉或?yàn)V紙過(guò)濾,，以達(dá)到單細(xì)胞狀態(tài)。
一般處理細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞,，采用生長(zhǎng)旺盛的對(duì)數(shù)期,，其變異率較高且重現(xiàn)性好。霉菌的菌株一般是多核的,，因此對(duì)霉菌都用孢子懸浮液進(jìn)行誘變,，對(duì)放線菌一般也如此。但孢子生理活性處于休眠狀態(tài),，誘變時(shí)不及營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞好,，因此最好采用剛剛成熟時(shí)的孢子，其變異率高,?；蛟谔幚砬皩㈡咦优囵B(yǎng)數(shù)小時(shí)，使其脫離靜止?fàn)顟B(tài),，則誘變率也會(huì)增加,。
　　一般處理真菌的孢子或酵母時(shí),，其菌懸液的濃度大約為106個(gè)／mL，細(xì)菌和放線菌的孢子的濃度大約為108個(gè)／mL,。
　?、?前培養(yǎng)
　　誘變處理前，將細(xì)胞在添加嘌呤,、嘧啶等堿基或酵母膏的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～60 min,，再進(jìn)行誘變處理，則變異率可大幅度提高,。
　?、?誘變
　　能誘發(fā)基因突變并使突變率提高到超過(guò)自然突變水平的物理化學(xué)因子都稱為誘變劑?？煞譃槲锢碚T變劑和化學(xué)誘變劑兩大類,。
　　⒌ 變異菌株的分離和篩選
　　通過(guò)誘變處理,，在微生物群體中出現(xiàn)各種突變型的個(gè)體,，但其中多數(shù)是負(fù)突變體。為在短時(shí)間內(nèi)獲得好的效果,，應(yīng)采用效率較高的篩選方案或篩選方法,。實(shí)際工作中，一般分初篩和復(fù)篩兩階段進(jìn)行,，前者以量為主,，后者以質(zhì)為主。

　　誘變育種一般采用物理,、化學(xué)誘變因素使微生物DNA的堿基排列發(fā)生變化,，以使排列錯(cuò)誤DNA模板形成異常的遺傳信息，造成某些蛋白結(jié)構(gòu)變異,，而使細(xì)胞功能發(fā)生改變,。誘變育種不僅可以提高菌株的生產(chǎn)能力，而且還可以改進(jìn)產(chǎn)品的質(zhì)量,，擴(kuò)大品種,，簡(jiǎn)化工藝。在科學(xué)實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)上都得到了廣泛應(yīng)用,。目前應(yīng)用于工業(yè)化的生產(chǎn)菌幾乎毫無(wú)例外地都是經(jīng)過(guò)誘變的改良菌種。
　　按照生產(chǎn)的要求,，根據(jù)生物的遺傳和變異的理論,，用人工的方法造成菌種變異，再經(jīng)過(guò)篩選,，而達(dá)到菌種選育的目的,。即就是通過(guò)誘變改善菌種的特性,，獲得優(yōu)良菌株。
誘變育種方案包括突變的誘發(fā),、突變株的篩選和突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn),。這些環(huán)節(jié)是相互聯(lián)系，缺一不可的,。在誘變育種的早期階段,，工作一般是順利的，高產(chǎn)突變株不斷涌現(xiàn),。但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期誘變得到的高產(chǎn)突變株,，再進(jìn)一步提高時(shí)，進(jìn)展逐漸變慢,，困難也越來(lái)越多,。因此，應(yīng)在早期周密地設(shè)計(jì)一個(gè)選育工作方案,。
　　誘發(fā)突變有可能出現(xiàn)多種多樣變異性突變株,。除了高產(chǎn)性狀外，還要考慮其他有利性狀,。例如,，生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)孢子多,；消除某些色素或無(wú)益組分,；能有效利用廉價(jià)發(fā)酵原材料；改善發(fā)酵工藝中某些缺陷(如泡沫過(guò)多,、對(duì)溫度波動(dòng)敏感,、菌絲量太多、自溶早,、過(guò)濾困難等),。但是所定的篩選目標(biāo)不可太多，要充分估計(jì)人力,、物力和測(cè)試能力等,，要考慮實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)的可能性。要選出一個(gè)達(dá)到一定產(chǎn)量的高產(chǎn)菌株,，往往要篩選數(shù)千個(gè)左右的突變株,，經(jīng)歷多次誘變和篩選，才能達(dá)到目的,。
　?、?突變的誘發(fā)
　　誘變劑所造成的DNA分子的某一位置的結(jié)構(gòu)改變稱為前突變。例如紫外線照射形成的胸腺嘧啶二聚體就是一種前突變,。前突變可以通過(guò)影響DNA復(fù)制而成為真正的突變,，也可以經(jīng)過(guò)修復(fù)重新回到原有的結(jié)構(gòu),，即不發(fā)生突變。許多環(huán)境因素可以影響突變的誘發(fā)過(guò)程,，從而影響突變率,。以下將討論從誘變劑進(jìn)入細(xì)胞到突變型出現(xiàn)的整個(gè)過(guò)程以及影響這一過(guò)程的一些因素。
　?、?誘變劑接觸DNA分子
　　誘變劑要進(jìn)入細(xì)胞才能誘發(fā)突變,，因此細(xì)胞對(duì)誘變劑的透性將影響誘變結(jié)果。誘變劑在接觸DNA之前要經(jīng)過(guò)細(xì)胞質(zhì),，細(xì)胞質(zhì)的某些組分和某些酶可和誘變劑相互作用而影響誘變效果,。
　　突變的誘發(fā)還和基因所處的狀態(tài)有關(guān)，而基因的狀態(tài)又和培養(yǎng)條件有關(guān),。在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑使基因處于轉(zhuǎn)錄狀態(tài),，可能有利于誘變劑的作用。據(jù)認(rèn)為在轉(zhuǎn)錄時(shí),，DNA雙鏈解開(kāi)更有利于誘變作用,。
　　⒉ DNA損傷的修復(fù)
　　DNA損傷的修復(fù)和基因突變有著密切的關(guān)系,。已發(fā)現(xiàn)微生物有五種修復(fù)DNA損傷方式,，它們是：光復(fù)活作用、切補(bǔ)修復(fù),、重組修復(fù),、SOS修復(fù)系統(tǒng)、DNA多聚酶的校正作用,。

圖4-2　三種DNA修復(fù)作用
　?、?光復(fù)活作用　人們發(fā)現(xiàn)某些經(jīng)紫外線照射過(guò)的放線菌孢子，如果在可見(jiàn)光下培養(yǎng)時(shí),，存活數(shù)明顯大于在黑暗中培養(yǎng)的同一樣品,。經(jīng)研究證明這是有一種為可見(jiàn)光所激活的酶在起作用。這種酶能和經(jīng)紫外線照射過(guò)的DNA在黑暗中結(jié)合,，形成的復(fù)合物置于可見(jiàn)光下,，酶和DNA解離，解離下來(lái)的DNA分子中不再存在原來(lái)的胸腺嘧啶二聚體,。見(jiàn)圖4-2(a),。
　　⑵ 切補(bǔ)修復(fù)　切補(bǔ)修復(fù)是在四種酶的協(xié)同作用下進(jìn)行DNA損傷修復(fù),，這四種酶都不需要可見(jiàn)光的激活,。首先在胸腺嘧啶二聚體5’端，在核酸內(nèi)切酶的作用下造成單鏈斷裂,；其次在核酸外切酶的作用下切除胸腺嘧啶二聚體,；然后在DNA多聚酶Ⅰ、Ⅲ的作用下進(jìn)行修補(bǔ)合成,；最后在DNA連接酶的作用下形成一個(gè)完整的雙鏈結(jié)構(gòu),。見(jiàn)圖4-2 (b)。
　?、?重組修復(fù)　重組修復(fù)必須在DNA進(jìn)行復(fù)制的情況下進(jìn)行,，所以又稱為復(fù)制后修復(fù)。重組修復(fù)是在不切除胸腺嘧啶二聚體的情況下進(jìn)行修復(fù)作用,。以帶有二聚體的單鏈為模板合成互補(bǔ)單鏈,，可是在每一個(gè)二聚體附近留下一個(gè)空隙。一般認(rèn)為通過(guò)染色體交換,，空隙部位就不再面對(duì)著二聚體,，而是面對(duì)著正常的單鏈，在這種情況下,，DNA多聚酶和連接酶就能把空隙部位修復(fù)好,。見(jiàn)圖4-2 (c)。
　?、?SOS修復(fù)系統(tǒng)　這是一種能夠造成誤差修復(fù)的“呼救信號(hào)”修復(fù)系統(tǒng),。當(dāng)DNA受到誘變劑損傷而阻斷DNA復(fù)制過(guò)程時(shí)，DNA損傷相當(dāng)于一個(gè)呼救信號(hào),，促使細(xì)胞中的有關(guān)酶系解除阻遏,，而進(jìn)行DNA的修復(fù)。在修復(fù)過(guò)程中,，DNA多聚酶在無(wú)模板的情況下進(jìn)行DNA的修復(fù)合成,，并將合成的DNA片段插入受損DNA的空隙處。SOS修復(fù)系統(tǒng)的修復(fù)作用容易導(dǎo)致基因突變,，大多數(shù)經(jīng)誘變所獲得的突變來(lái)源于此修復(fù)系統(tǒng)的作用,。
　　⑸ DNA多聚酶的校正作用　除了上述種種修復(fù)作用以外,，細(xì)胞還具有對(duì)復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)差錯(cuò)加以校正的功能,。大腸桿菌中DNA的復(fù)制依賴于三種DNA多聚酶(多聚酶Ⅰ、Ⅱ,、Ⅲ)的作用,，這三種酶除了對(duì)于多核苷酸的多聚作用以外，還具有3’到5’核酸外切酶的作用,。一般認(rèn)為依靠DNA多聚酶的這一作用,，能在復(fù)制過(guò)程中隨時(shí)切除不正常的核苷酸。如果DNA多聚酶發(fā)生突變而使其核酸外切酶活性減弱,，那么,，它切除不正常核苷酸的能力減弱,，菌體的突變率相應(yīng)地提高，成為增變突變型,。DNA多聚酶為DNA修復(fù)作用所必需,，所以增變突變型對(duì)于誘變劑的作用格外敏感。
　?、?從前突變到突變
　　前突變形成后,，細(xì)胞中幾種修復(fù)系統(tǒng)就會(huì)對(duì)它施加作用。從對(duì)突變誘發(fā)的影響看,，修復(fù)系統(tǒng)可以分為校正差錯(cuò)和引起差錯(cuò)這兩類,。一般認(rèn)為光復(fù)活作用、切補(bǔ)修復(fù)和DNA多聚酶校正作用這三種修復(fù)作用具有校正差錯(cuò)的性質(zhì)而不利于突變的誘發(fā),，而重組修復(fù)和SOS修復(fù)系統(tǒng)這兩種修復(fù)作用具有引起差錯(cuò)的性質(zhì)而有利于突變的發(fā)生,。
　　可以認(rèn)為，一切影響這些修復(fù)系統(tǒng)中的酶活性的因素都能影響由前突變到突變這一過(guò)程,。例如,，咖啡堿能抑制切補(bǔ)修復(fù)系統(tǒng)，因而增強(qiáng)誘變作用,；氯霉素能抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成,，從而抑制了依賴于蛋白質(zhì)合成的SOS修復(fù)系統(tǒng)和重組修復(fù)，降低誘變率,。相反地,，一切有利于蛋白質(zhì)合成的因素都有利于提高突變率。
　　與突變有關(guān)的一些酶的激活劑或抑制劑也會(huì)影響突變率,。Ba2+對(duì)DNA多聚酶的3’核酸外切酶活性有抑制作用,，從而可提高突變率。
　　從上述可以看出,，誘變前后的處理可影響誘變的效果,。其原因主要有兩方面：一是通過(guò)影響與DNA修復(fù)作用有關(guān)的酶活性而影響誘變的效果；二是通過(guò)使誘變的目的基因處于活化狀態(tài)(復(fù)制或轉(zhuǎn)錄狀態(tài)),，使之更容易被誘變劑所作用,，從而影響目的基因的突變率。
　?、?從突變到突變表型
　　突變基因的出現(xiàn)并不等于突變表型的出現(xiàn),，表型的改變落后于基因型改變的現(xiàn)象稱為表型遲延。表型遲延有兩種原因：分離性遲延和生理性遲延,。
　?、?分離性遲延　分離性遲延實(shí)際上是經(jīng)誘變處理后，細(xì)胞中的基因處于不純的狀態(tài)(野生型的基因和突變型的基因并存于同一細(xì)胞中)，突變型基因由于屬于隱性基因而暫時(shí)得不到表達(dá),，需經(jīng)過(guò)復(fù)制,、分離，在細(xì)胞中處于純的狀態(tài)(一細(xì)胞中只有突變型基因,，沒(méi)有野生型基因)時(shí),，其性狀才得以表達(dá),。
　　大腸桿菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期含有2～4個(gè)核質(zhì)體,，當(dāng)其中一個(gè)核發(fā)生突變時(shí)，這個(gè)細(xì)胞變成異核體,。如果突變表型表現(xiàn)為某個(gè)基因所控制的產(chǎn)物的喪失,，那么這一突變?cè)诋惡梭w內(nèi)就是隱性的。因?yàn)槠渌暮死^續(xù)生產(chǎn)該基因控制的產(chǎn)物,。需要經(jīng)歷1～2個(gè)世代,，通過(guò)細(xì)胞分裂而出現(xiàn)同一細(xì)胞的所有核中都帶有這一突變基因時(shí)，突變表型才出現(xiàn),。
　?、?生理性遲延　突變基因由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)時(shí)，還不一定出現(xiàn)突變表型,，新的表型必須等到原有基因的產(chǎn)物稀釋到某一程度后才能表現(xiàn)出來(lái),。而這些原有基因產(chǎn)物的濃度降低到能改變表型的臨界水平以前，細(xì)胞已經(jīng)分裂多次,，經(jīng)過(guò)了好幾個(gè)世代,。例如某個(gè)產(chǎn)酶基因發(fā)生了突變，可是細(xì)胞中原有的酶仍在起作用,，細(xì)胞所表現(xiàn)的仍是野生型表型,。只有通過(guò)細(xì)胞分裂，原有的酶已經(jīng)足夠稀釋或失去活性時(shí),，才出現(xiàn)突變型的表型,。生理性遲延最明顯的例子是噬菌體抗性突變的表達(dá)。用誘變劑處理噬菌體敏感菌,，將存活菌體立即分離在含噬菌體的培養(yǎng)基上,，其抗性菌株不立即出現(xiàn)。而將存活菌先在不含噬菌體的培養(yǎng)基中繁殖幾代后,，再分離后接到含有噬菌體的培養(yǎng)基中,，則可得到大量抗性菌。有些誘發(fā)突變要經(jīng)歷十幾個(gè)世代才能表達(dá),。敏感菌對(duì)某一些噬菌體敏感是因?yàn)槠浼?xì)胞表面具有該噬菌體的受體,，抗性菌因不產(chǎn)生該受體而對(duì)噬菌體具有抗性。但是基因發(fā)生了抗性突變而細(xì)胞表面具有受體的細(xì)胞仍會(huì)受到噬菌體的感染，抗性突變的表型必須等到經(jīng)過(guò)多次細(xì)胞分離,，細(xì)胞表面不再存在有受體時(shí)才能表現(xiàn)出來(lái),。
　　㈡ 誘變劑的種類及選擇
　?、?誘變劑
　　物理誘變劑主要為各種射線,，如紫外線、X射線,、α射線,、β射線、γ射線和超聲波等,，其中以紫外線應(yīng)用最廣,，紫外光譜作用光譜正好與細(xì)胞內(nèi)的核酸的吸收光譜相一致，因此在紫外光的作用下能使DNA鏈斷裂,、DNA分子內(nèi)和分子間發(fā)生交聯(lián)形成嘧啶二聚體,，從而導(dǎo)致菌體的遺傳性狀發(fā)生改變。
　　化學(xué)誘變劑的種類較多,，常用的有甲基磺酸乙酯(EMS),、亞硝基胍、亞硝酸,、氮芥等,。它們作用于微生物細(xì)胞后，能夠特異地與某些基團(tuán)起作用,，即引起物質(zhì)的原發(fā)損傷和細(xì)胞代謝方式的改變,，失去親株原有的特性，并建立起新的表型,。所謂“表型”是指某一生物個(gè)體能夠觀察到的特殊性狀,。所謂“基因型（遺傳型）”是指某一生物個(gè)體所含有的全部遺傳因子（即基因組）所攜帶的遺傳信息。
　　誘變劑亞硝基胍和甲基磺酸乙酯雖然誘變效果好,，但由于多數(shù)引起堿基對(duì)轉(zhuǎn)換,，得到的變異株回變率高。電離輻射,、紫外線和吖啶類等誘變劑,，能引起缺失、閱讀密碼組移動(dòng)等巨大損傷,，則不易產(chǎn)生回復(fù)突變,。誘變處理劑量的選擇是一個(gè)比較復(fù)雜的問(wèn)題，一般正突變較多出現(xiàn)在偏低劑量中,，而負(fù)突變則較多地出現(xiàn)于偏高劑量中,。對(duì)于經(jīng)過(guò)多次誘變而提高了產(chǎn)量的菌株，在較高劑量負(fù)突變率更高。因此,，目前處理量已從以前采用的死亡率90％～99％減低為死亡率70％～80％,。各種化學(xué)誘變劑常用的劑量和處理時(shí)間如表4-1。
表4-1　各種化學(xué)誘變劑常用的劑量,、處理時(shí)間

　　誘變劑的選擇主要是根據(jù)已經(jīng)成功的經(jīng)驗(yàn),，誘變作用不但決定于誘變劑，還與菌種的種類和出發(fā)菌株的遺傳背景有關(guān),。一般對(duì)遺傳上不穩(wěn)定的菌株,，可采用溫和的誘變劑，或采用已見(jiàn)效果的誘變劑,；對(duì)于遺傳上較穩(wěn)定的菌株則采用強(qiáng)烈的,、不常用的、誘變譜廣的誘變劑,。要重視出發(fā)菌株的誘變系譜，不應(yīng)常采用同一種誘變劑反復(fù)處理,，以防止誘變效應(yīng)飽和,；但也不要頻頻變換誘變劑，以避免造成菌種的遺傳背景復(fù)雜,，不利于高產(chǎn)菌株的穩(wěn)定,。
　　選擇誘變劑時(shí)，還應(yīng)該考慮誘變劑本身的特點(diǎn),。例如紫外線主要作用于DNA分子的嘧啶堿基,，而亞硝酸則主要作用于DNA分子的嘌呤堿基。紫外線和亞硝酸復(fù)合使用,，突變譜寬,，誘變效果好。
　?、?影響誘變效果的因素
　　除了出發(fā)菌株的遺傳特性和誘變劑會(huì)影響誘變效果之外,，菌種的生理狀態(tài)、被處理菌株的預(yù)培養(yǎng)和后培養(yǎng)條件以及誘變處理時(shí)的外界條件等都會(huì)影響誘變效果,。
菌種的生理狀態(tài)與誘變效果有密切關(guān)系,，例如有的堿基類似物、亞硝基胍(NTG)等只對(duì)分裂中的DNA有效,，對(duì)靜止的或休眠的孢子或細(xì)胞無(wú)效,；而另外一些誘變劑，如紫外線,、亞硝酸,、烷化劑、電離輻射等能直接與DNA起反應(yīng)，因此對(duì)靜止的細(xì)胞也有誘變效應(yīng),，但是對(duì)分裂中的細(xì)胞更有效,。因此，放線菌,、真菌的孢子誘變前經(jīng)培養(yǎng)稍加萌發(fā)可以提高誘變率,。
誘變處理前后的培養(yǎng)條件對(duì)誘變效果有明顯的影響?？稍谂囵B(yǎng)基中添加某些物質(zhì)(如核酸堿基,、咖啡因、氨基酸,、氯化鋰,、重金屬離子等等)來(lái)影響細(xì)胞對(duì)DNA損傷的修復(fù)作用，使之出現(xiàn)更多的差錯(cuò),，而達(dá)到提高誘變率的目的,。例如菌種在紫外線處理前，在富有核酸堿基的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，能增加其對(duì)紫外線的敏感性,。相反，如果菌種在進(jìn)行紫外線處理以前,，培養(yǎng)于含有氯霉素(或缺乏色氨酸)的培養(yǎng)基中,，則會(huì)降低突變率,。紫外線誘變處理后,，將孢子液分離于富有氨基酸的培養(yǎng)基中，則有利于菌種發(fā)生突變,。
　　誘變率還受到其他外界條件,，例如溫度,、氧氣、pH值,、可見(jiàn)光等的影響,。
　　㈢ 出發(fā)菌株的選擇
　　突變的誘發(fā)受到菌種的遺傳特性,、誘變劑,、菌種的生理狀態(tài)以及誘變處理時(shí)環(huán)境條件的影響。出發(fā)菌株的選擇是誘變育種工作成敗的關(guān)鍵,。出發(fā)菌株的性能,，如菌種的系譜、菌種的形態(tài),、生理,、傳代,、保存等特性，對(duì)誘變效果影響很大,。挑選出發(fā)菌株應(yīng)考慮如下幾點(diǎn),。
　　① 選擇純種作為出發(fā)菌株,，借以排除異核體或異質(zhì)體（表型相同,，基因型不同）的影響。從宏觀上講,，就是要選擇發(fā)酵產(chǎn)量穩(wěn)定,、波動(dòng)范圍小的菌株為出發(fā)菌株。如果出發(fā)菌株遺傳性不純,，可以用自然分離或用緩和的誘變劑進(jìn)行處理,，取得純種作為出發(fā)菌株。這樣雖然要花一些時(shí)間,，但效果更好,。
　　② 選擇出發(fā)菌株,，不僅是選產(chǎn)量高的,，還應(yīng)該考慮其他因素。如產(chǎn)孢子早而多,，色素多或少，生長(zhǎng)速度快等有利于合成發(fā)酵產(chǎn)物的性狀,。特別重要的是選擇的出發(fā)菌株應(yīng)當(dāng)具有我們所需要的代謝特性,。例如，適合補(bǔ)料工藝的高產(chǎn)菌株是從糖,、氮代謝速度較快的出發(fā)菌株得來(lái)的,。用生活力旺盛而發(fā)酵產(chǎn)量又不很低的形態(tài)回復(fù)突變株作為出發(fā)菌株，?？墒盏胶玫男Ч?。
　　③ 選擇對(duì)誘變劑敏感的菌株作為出發(fā)菌株,，不但可以提高變異頻率,，而且高產(chǎn)突變株的出現(xiàn)率也大。生產(chǎn)中經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期選育的菌株,，有時(shí)會(huì)對(duì)誘變劑不敏感,。在此情況下，應(yīng)設(shè)法改變菌株的遺傳型,，以提高菌株對(duì)誘變劑的敏感性,。雜交,、誘發(fā)抗性突變和采用大劑量的誘變劑處理均能改變菌株的遺傳性而提高菌株對(duì)誘變劑的敏感性。
　?、?篩選的方法
　?、?制定篩選方案

圖4-3　誘變篩選的典型流程
　　方案設(shè)計(jì)的中心內(nèi)容是確定誘變篩選流程，流程示意如圖4-3,。整個(gè)流程可按誘變和篩選兩部分說(shuō)明如下,。
　　由出發(fā)菌種開(kāi)始，制出新鮮孢子懸浮液(或細(xì)菌懸浮液)作誘變處理,，然后以一定稀釋度涂布平皿,，至平皿上長(zhǎng)出單菌落為止的各步驟為誘變過(guò)程。出發(fā)菌種的斜面非常重要,。其培養(yǎng)工藝最好是經(jīng)過(guò)試驗(yàn)已知的最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,。要選取對(duì)誘變劑最敏感的斜面種齡，要求孢子數(shù)適中而新鮮,。在平皿內(nèi)傾入10 mL左右的培養(yǎng)基,，凝固后，加入一定量經(jīng)誘變處理的孢子液,，用涂布器涂勻后進(jìn)行單菌落分離培養(yǎng),。
　　篩選過(guò)程主要包括傳種斜面、菌株保藏和篩選高產(chǎn)菌株這三項(xiàng)工作,。長(zhǎng)出單菌落后,，隨機(jī)挑選單菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力測(cè)定。每一被挑選的單菌落傳種斜面后,，再由斜面接入模擬發(fā)酵工藝的搖瓶中培養(yǎng),，然后測(cè)定其生產(chǎn)能力。挑選生長(zhǎng)良好的正常形態(tài)的菌落傳種斜面,，還可適當(dāng)挑選少數(shù)形態(tài)或色素有變異的菌落,。經(jīng)誘變處理，形態(tài)嚴(yán)重變異的往往為低產(chǎn)菌株,。經(jīng)篩選挑出比對(duì)照生產(chǎn)能力高10％以上的菌株,，要制成砂土管或冷凍管留種保藏。這一步非常重要,，可保證高產(chǎn)菌株不會(huì)得而復(fù)失,。誘變處理前后孢子要計(jì)數(shù)，以控制處理液的孢子數(shù)和統(tǒng)計(jì)誘變致死率,，常用于處理的孢子液濃度為105～l08個(gè)／mL,。孢子計(jì)數(shù)采用血球計(jì)數(shù)法在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。致死率是通過(guò)處理前后孢子液活菌計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定,。
　?、?營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選方法
　　營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotroph）是指原菌株由于發(fā)生基因突變,，致使合成途徑中某一步驟發(fā)生缺陷，從而喪失了合成某些物質(zhì)的能力,，必須在培養(yǎng)中外源補(bǔ)加該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)才能生長(zhǎng)的突變型菌株,。原養(yǎng)型（prototroph）一般指營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，其營(yíng)養(yǎng)要求在表型上與野生型（wild type）相同,，如能在基本培養(yǎng)基（MM）上生長(zhǎng),，但基因型不一定相同。
　　營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選,，一般是經(jīng)誘變后,，再經(jīng)中間培養(yǎng)、淘汰野生型,、檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型,、確定生長(zhǎng)譜等步驟。中間培養(yǎng)的目的是減少以后篩選中再產(chǎn)生分離子,，其培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基（CM）或補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM）,，并且培養(yǎng)過(guò)夜。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法,、菌絲過(guò)濾法,、差別殺菌法和饑餓法等。其目的在于濃縮缺陷型菌株,。當(dāng)誘變后的缺陷型數(shù)量較大時(shí),，也可省去中間培養(yǎng)和淘汰野生型等過(guò)程。營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株的檢出方法有：逐個(gè)測(cè)定法,、夾層平板法,、限量營(yíng)養(yǎng)法和影印接種法等。經(jīng)過(guò)檢出確定為營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株之后,，尚需進(jìn)一步確定它的缺陷型是氨基酸、維生素,，還是嘌呤,、嘧啶缺陷型。
　　經(jīng)過(guò)平皿初篩,，確定營(yíng)養(yǎng)缺陷或其他標(biāo)記的變異性狀后,，即可進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，檢查其生產(chǎn)性狀,，經(jīng)過(guò)生產(chǎn)性狀比較,，再平行試驗(yàn)比較，并結(jié)合生產(chǎn)的其他因素考慮,，可確定用于生產(chǎn)或進(jìn)一步改良誘變的菌株,，進(jìn)行保藏或擴(kuò)大試驗(yàn),，直至用于生產(chǎn)等。
　?、?突變株的篩選
　　誘變處理后的孢子傳種斜面后,，進(jìn)行生產(chǎn)能力測(cè)試篩選。為了獲得優(yōu)良菌株,，初篩菌株的量要大,，發(fā)酵和測(cè)試的條件都可粗放一些。例如可以采用瓊脂塊篩選法進(jìn)行初篩,，也可以采用一個(gè)菌株進(jìn)一個(gè)搖瓶的方法進(jìn)行初篩,。隨著以后一次一次的復(fù)篩，對(duì)發(fā)酵和測(cè)試條件的要求應(yīng)逐步提高,，復(fù)篩一般每個(gè)菌株進(jìn)3～5個(gè)搖瓶,，如果生產(chǎn)能力繼續(xù)保持優(yōu)異，再重復(fù)幾次復(fù)篩,。初篩和復(fù)篩均需有親株作對(duì)照以比較生產(chǎn)能力是否優(yōu)良,。復(fù)篩后，對(duì)于有發(fā)展前途的優(yōu)良菌株,，可考察其穩(wěn)定性,、菌種特性和最適培養(yǎng)條件等。真正的高產(chǎn)菌株,，往往需要經(jīng)過(guò)產(chǎn)量提高的逐步累積過(guò)程,，才能變得越來(lái)越明顯。所以有必要多挑選一些出發(fā)菌株進(jìn)行多步育種,，以確保挑選出高產(chǎn)菌株,。
　　根據(jù)形態(tài)變異淘汰低產(chǎn)菌株。突變一旦發(fā)生,，突變細(xì)胞能夠把突變的性狀遺傳給子代,。如果誘變處理確實(shí)有效的話，在一定的培養(yǎng)基上,，很容易發(fā)現(xiàn)一些菌落的性狀或色澤等和親代菌株不同,，這可作為誘變效果的定性指標(biāo)。某些菌落形態(tài)與生產(chǎn)性能有直接的相關(guān)性,，可采取在平皿直接篩選,。如在灰黃霉素生產(chǎn)菌的選育中，菌落暗紅色變深者,，產(chǎn)量就提高,。但就目前的研究，多數(shù)變異其菌落外觀形態(tài)與生理的相應(yīng)關(guān)系尚未完全清楚,。
　　根據(jù)平皿直接反應(yīng)挑取高產(chǎn)菌株,。所謂平皿直接反應(yīng)是指每個(gè)菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基內(nèi)的指示物作用后的變色圈或透明圈等,。因其可表示菌株的生產(chǎn)活力高低,，所以可以作為初篩的標(biāo)志,，常用的有紙片培養(yǎng)顯色法,、透明圈法、瓊脂片法,、深度梯度法。菌體細(xì)胞經(jīng)誘變劑處理后,，要從大量的變異菌株中,，把一些具有優(yōu)良性狀的突變株挑選出來(lái),，這需要有明確的篩選目標(biāo)和篩選方法,，需要進(jìn)行認(rèn)真細(xì)致的篩選工作。育種工作中常采用隨機(jī)篩選和理性化篩選這兩種篩選方法,。
　?、?隨機(jī)篩選　隨機(jī)篩選即菌種經(jīng)誘變處理后,，進(jìn)行平板分離,，隨機(jī)挑選單菌落，從中篩選高產(chǎn)菌株。為了提高篩選效率，可采用下列方法增大篩選量,。
　?、?搖瓶篩選法,。這是生產(chǎn)上一直使用的傳統(tǒng)方法,。即將挑出的單菌落傳種斜面后，再由斜面接入模擬發(fā)酵工藝的搖瓶中培養(yǎng),，然后測(cè)定其發(fā)酵生產(chǎn)能力,。選育高產(chǎn)菌株的目的是要在生產(chǎn)發(fā)酵罐中推廣應(yīng)用，因此,，搖瓶的培養(yǎng)條件要盡可能和發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)條件相近,。但是,，實(shí)際上搖瓶培養(yǎng)條件很難和發(fā)酵罐培養(yǎng)條件相同。搖瓶篩選的優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)條件與生產(chǎn)培養(yǎng)條件相接近,。但工作量大,、時(shí)間長(zhǎng),、操作復(fù)雜,。
　?、?瓊脂塊篩選法。這是一種簡(jiǎn)便,、迅速的初篩方法,。將單菌落連同其生長(zhǎng)培養(yǎng)基(瓊脂塊)用打孔器取出，培養(yǎng)一段時(shí)間后,，置于鑒定平板以測(cè)定其發(fā)酵產(chǎn)量,。瓊脂塊篩選法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、速度快,。但是,，固體培養(yǎng)條件和液體培養(yǎng)條件之間是有差異的,，利用此法所取得的初篩結(jié)果必須經(jīng)搖瓶復(fù)篩加以驗(yàn)證。
　?、?篩選自動(dòng)化和篩選工具微型化,。近年來(lái)，在研究篩選自動(dòng)化方面有很大進(jìn)展,，篩選實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化和半自動(dòng)化,，省去了繁瑣的勞動(dòng)，大大提高了篩選效率,。篩選工具的微型化也是很有意義的，例如將一些小瓶子取代現(xiàn)有的發(fā)酵搖瓶,，在固定框架中振蕩培養(yǎng),，可使操作簡(jiǎn)便，又可加大篩選量,。
　?、?理性化篩選　傳統(tǒng)的菌種選育是采用隨機(jī)篩選的方法。由于正變異株出現(xiàn)的幾率小,，產(chǎn)量提高的范圍往往在生物學(xué)波動(dòng)的范圍內(nèi),，因而選出一株高產(chǎn)菌株需要耗費(fèi)大量的人力、物力,。而且,，隨著發(fā)酵產(chǎn)量不斷提高，用隨機(jī)篩選方法獲得高產(chǎn)菌株的幾率越來(lái)越小,。近年來(lái),，隨著遺傳學(xué)、生物化學(xué)知識(shí)的積累,，人們對(duì)于代謝途徑,、代謝調(diào)控機(jī)制了解得更多，因而篩選方法逐漸從隨機(jī)篩選轉(zhuǎn)向理性化篩選,。理性化篩選是指運(yùn)用遺傳學(xué),、生物化學(xué)的原理，根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能的生物合成途徑,、代謝調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)和采用一些篩選方法,，以打破微生物原有的代謝調(diào)控機(jī)制，獲得能大量形成產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株,。微生物的代謝產(chǎn)物不同,，其篩選方法也有所不同。
　?、?初級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選,。根據(jù)代謝調(diào)控的機(jī)理,，氨基酸、核苷酸,、維生素等小分子初級(jí)代謝產(chǎn)物的合成途徑中普遍存在著反饋?zhàn)瓒艋蚍答佉种?，這對(duì)于生產(chǎn)菌本身是有意義的，因?yàn)榭梢员苊夂铣蛇^(guò)多的代謝物而造成能量的浪費(fèi),。
表4-2　反饋?zhàn)瓒襞c反饋抑制的比較

　　酶活性的抑制包括競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反饋抑制,。反饋抑制是指反應(yīng)途徑中某些中間產(chǎn)物或末端產(chǎn)物對(duì)該途徑中前面反應(yīng)的影響。凡使反應(yīng)加速的稱為正反饋,，凡使反應(yīng)減速的稱為負(fù)反饋,。酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制可用Monod提出的變構(gòu)酶學(xué)說(shuō)予以說(shuō)明。
末端產(chǎn)物的反饋抑制普遍存在于合成途徑,。有兩種似上的末端產(chǎn)物的分支代謝途徑的反饋抑制,，作用機(jī)制較復(fù)雜，其調(diào)節(jié)方式見(jiàn)圖4-4,。

圖4-4　反饋抑制模式圖
　　(a) 協(xié)同反饋抑制　此種抑制作用的特點(diǎn)是分支途徑的幾種末端產(chǎn)物同時(shí)過(guò)量時(shí)才抑制共同途徑中的第一個(gè)酶活性,。如谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)合成天冬氨酸族氨基酸時(shí)，天冬氨酸激酶受到賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制,。
　　(b) 累積反饋抑制　此種抑制作用的特點(diǎn)是每一種末端產(chǎn)物按一定百分率單獨(dú)抑制共同途徑中第一個(gè)酶活性,。各種產(chǎn)物間既無(wú)協(xié)同效應(yīng)，又無(wú)拮抗作用,。它們抑制的酶,，有的是同功酶(能催化同一種生化反應(yīng)，但酶分子結(jié)構(gòu)有所不同的一組酶),，有的是多功能酶(指結(jié)構(gòu)上僅為一種多肽,，但卻具有兩種或兩種以上催化活力的酶蛋白)。如谷氨酰胺合成酶受到八種末端產(chǎn)物的累積反饋抑制,。
　　(c) 增效反饋抑制　其特點(diǎn)是代謝途徑中任何一種末端產(chǎn)物過(guò)量時(shí),，僅部分抑制共同反應(yīng)途徑中的第一個(gè)酶活性，但是兩個(gè)末端產(chǎn)物同時(shí)過(guò)量時(shí),，其抑制作用可超過(guò)各產(chǎn)物存在的抑制能力的總和,。此種調(diào)節(jié)方式發(fā)現(xiàn)在6-氨基嘌呤核苷酸和6-酮基嘌呤核苷酸生物合成途徑。兩類核苷酸各自都能部分地抑制磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)酰胺酶的活性,。而6-氨基和6-酮基嘌呤核苷酸混合物(GMP+AMP或AMP+IMP)對(duì)該酶有強(qiáng)烈地抑制作用,。
　　(d) 順序反饋抑制　每個(gè)分支末端產(chǎn)物抑制分支后的第一個(gè)酶，產(chǎn)生部分抑制作用,。如枯草桿菌合成芳香族氨基酸時(shí)的反饋抑制作用,。
但是，在工業(yè)生產(chǎn)中,，需要生產(chǎn)菌產(chǎn)生大量的氨基酸,、核苷酸,、維生素等產(chǎn)物。因此,，需要打破微生物原有的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng),。育種工作要達(dá)到此目的，可從以下兩個(gè)方面著手,。
　?、?降低終產(chǎn)物濃度
　　(a) 篩選終產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)缺陷型　如圖4-5所示。在圖4-5中,，假設(shè)所需要的發(fā)酵產(chǎn)物是C,，而該生物合成途徑的終產(chǎn)物是E，則可篩選E的營(yíng)養(yǎng)缺陷型,；如果營(yíng)養(yǎng)缺陷型是由C→D的代謝被阻斷,，則可解除終產(chǎn)物E對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物C合成的反饋?zhàn)瓒艋蚍答佉种疲e累大量的發(fā)酵產(chǎn)物C,。

圖4-5　在簡(jiǎn)單的代謝途徑中積累中間產(chǎn)物

圖4-6　賴氨酸的大量生成
　　實(shí)例見(jiàn)圖4-6。在谷氨酸棒桿菌的原始菌株中,，賴氨酸和蘇氨酸協(xié)同反饋抑制天冬氨酸激酶,，獲得了一個(gè)缺少高絲氨酸脫氫酶的突變株。它的生長(zhǎng)需要蘇氨酸和蛋氨酸,。如果蘇氨酸以限制生長(zhǎng)的濃度加入時(shí),，協(xié)同反饋抑制被打破而大量產(chǎn)生賴氨酸，谷氨酸棒桿菌的雙氫吡啶二羧酸合成酶對(duì)賴氨酸的反饋抑制不敏感,。
　　總之,，篩選終產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)缺陷型適合于下面三種情況：發(fā)酵產(chǎn)物為某一直線合成途徑的中間產(chǎn)物如圖4-5所示；發(fā)酵產(chǎn)物為某一分枝合成途徑的中間產(chǎn)物,；發(fā)酵產(chǎn)物為某一分枝合成途徑的一個(gè)終產(chǎn)物時(shí),，可篩選該分枝合成途徑的另一終產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，如圖4-6所示,。
　　(b) 篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株　使之大量分泌排出終產(chǎn)物,，以降低細(xì)胞內(nèi)終產(chǎn)物濃度，從而避免終產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié),。例如,，用谷氨酸棒桿菌的生物素營(yíng)養(yǎng)缺陷型(biotin deficiency)進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，生物素是合成脂肪酸所必需的,，而脂肪酸又是組成細(xì)胞膜類脂的必要成分,。該缺陷型在生物素處于限量的情況下，不利于脂肪酸的合成,，因而使細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生變化,，有利于將谷氨酸透過(guò)細(xì)胞膜分泌至胞外的發(fā)酵液中,。如果使用油酸缺陷型菌株或者甘油缺陷型菌株，即使在生物素過(guò)量的條件下,，也可使谷氨酸在胞外大量積累,。
　　Ⅱ 篩選抗反饋突變菌株
　　(a) 篩選結(jié)構(gòu)類似物(抗代謝物)抗性突變株　分離抗反饋突變株的最常用的方法是用與代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似的化合物(結(jié)構(gòu)類似物)處理微生物細(xì)胞群體,，殺死或抑制絕大多數(shù)細(xì)胞,，選出能大量產(chǎn)生該代謝物的抗反饋突變株。結(jié)構(gòu)類似物一方面具有和代謝物相似的結(jié)構(gòu),，因而具有和代謝物相似的反饋調(diào)節(jié)作用,，阻礙該代謝物的生成；另一方面它不同于代謝物,，不具有正常的生理功能,，對(duì)細(xì)胞的正常代謝有阻礙作用，會(huì)抑制菌的生長(zhǎng)或?qū)е戮乃劳?。例如,，一種氨基酸終產(chǎn)物，在正常的情況下,，參與蛋白質(zhì)合成,，過(guò)量時(shí)可抑制或阻遏它自身的合成酶類。如果這種氨基酸的結(jié)構(gòu)類似物也顯示這種抑制或阻遏,，但卻不能用于蛋白質(zhì)的合成,，那么當(dāng)用這種結(jié)構(gòu)類似物處理菌株時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞將由于缺少該種氨基酸而不能生長(zhǎng)或者死亡,，而那些對(duì)該結(jié)構(gòu)類似物不敏感的突變株,，仍然能夠合成該種氨基酸而繼續(xù)生長(zhǎng)。某些菌株所以能抵抗這種結(jié)構(gòu)類似物,，是因?yàn)楸辉摪被?或結(jié)構(gòu)類似物)反饋抑制的酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變(抗反饋抑制),，或者被阻遏的酶的生成系統(tǒng)發(fā)生了改變(抗反饋?zhàn)瓒?。由于突破了原有的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng),，這些突變株就可產(chǎn)生大量的該種氨基酸,。
　　例如選育L-精氨酸（L-Arg）高產(chǎn)菌株，可采用篩選結(jié)構(gòu)類似物D-Argr菌株的方法（一般文獻(xiàn)中采用上標(biāo)“r”表示抗性,，“s”表示敏感型）,。
　　(b) 利用回復(fù)突變篩選抗反饋突變菌株　經(jīng)誘變處理出發(fā)菌株，先選出對(duì)產(chǎn)物敏感的營(yíng)養(yǎng)缺陷型,，再將營(yíng)養(yǎng)缺陷型進(jìn)行第二次誘變處理得到回復(fù)突變株,。篩選的目的不是要獲得完全恢復(fù)原有狀態(tài)的回復(fù)突變株，而是希望經(jīng)過(guò)兩次誘發(fā)突變,，所得的回復(fù)突變株有可能改變了產(chǎn)物合成酶的調(diào)節(jié)部位的氨基酸的順序,，使之不能和產(chǎn)物結(jié)合,，因而不受產(chǎn)物的反饋抑制。例如,，谷氨酸棒桿菌的肌苷酸脫氫酶的回復(fù)突變株對(duì)其終產(chǎn)物鳥(niǎo)苷酸的反饋調(diào)節(jié)不敏感,，從而提高了鳥(niǎo)苷酸的產(chǎn)量。

　?、?次級(jí)代謝產(chǎn)物(主要是抗生素)高產(chǎn)菌株的篩選,。次級(jí)代謝是某些生物為了避免在初級(jí)代謝過(guò)程中某些中間產(chǎn)物積累所造成的不利作用而產(chǎn)生的一類有利于生存的代謝類型。初級(jí)代謝與次級(jí)代謝都受到核內(nèi)遺傳物質(zhì)的控制,，次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成同時(shí)還受到核外遺傳物質(zhì)——質(zhì)粒的控制,，有人將這種代謝產(chǎn)物叫做質(zhì)粒產(chǎn)物。次級(jí)代謝有不同于初級(jí)代謝的特點(diǎn),，因此其篩選方法也和初級(jí)代謝略有不同,。次級(jí)代謝產(chǎn)物不是菌體生長(zhǎng)、繁殖所必需的,，往往不能簡(jiǎn)單地采用篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型或結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株的方法來(lái)獲得高產(chǎn)菌株,。
　　次級(jí)代謝又受到初級(jí)代謝的調(diào)節(jié)，次級(jí)代謝和初級(jí)代謝有一些共同的中間產(chǎn)物,，這些中間產(chǎn)物可以進(jìn)而合成初級(jí)代謝產(chǎn)物,，也可以進(jìn)而合成次級(jí)代謝產(chǎn)物，這取決于菌的遺傳特性和生理狀態(tài),，這些中間產(chǎn)物叫做分叉中間體。微生物的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)趨向于平衡地利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),，當(dāng)環(huán)境中某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)剩,，而某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏時(shí)，菌體不能有效的攝入營(yíng)養(yǎng),，在代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)作用下,，菌的生長(zhǎng)繁殖速率下降，并通過(guò)代謝途徑的改變將過(guò)剩的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成與生長(zhǎng)繁殖無(wú)關(guān)的次級(jí)代謝產(chǎn)物,。因此,，可篩選某些營(yíng)養(yǎng)缺陷型或初級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株以消除初級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)那些共同中間產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)，使之大量積累而有利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成,。大多數(shù)菌株在被快速利用的碳,、氮、磷源消耗至一定程度時(shí)才產(chǎn)生有活性的次級(jí)代謝酶,，因此篩選解除分解代謝調(diào)節(jié)突變株,，可以獲得高產(chǎn)菌。
　　次級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選方法如下：
　　(a) 利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選,?？股禺a(chǎn)生菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型大多為低產(chǎn)菌株,，但是如果某些次級(jí)代謝和初級(jí)代謝處于同一分枝合成途徑時(shí)，篩選初級(jí)代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型?？墒瓜鄳?yīng)的次級(jí)代謝產(chǎn)物增產(chǎn),。例如，芳香族氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型可能增產(chǎn)氯霉素,，芳香族氨基酸和氯霉素的生物合成途徑中有一個(gè)共同的中間代謝物莽草酸,，當(dāng)誘變處理使莽草酸→芳香族氨基酸的生物合成出現(xiàn)遺傳性阻礙時(shí)，菌體不能夠合成芳香族氨基酸,，從而避免了芳香族氨基酸對(duì)莽草酸生物合成的反饋調(diào)節(jié),，莽草酸得以大量合成，進(jìn)而合成大量的氯霉素,。同樣的道理,，脂肪酸和制霉菌素、四環(huán)素,、灰黃霉素有共同的中間代謝物丙二酰CoA,，脂肪酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型可以增產(chǎn)上述的抗生素。類似的例子還有頭孢菌素產(chǎn)生菌的亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型可增產(chǎn)頭孢菌素C,，亮氨酸和纈氨酸有共同的中間代謝物α-酮基異戊酸,，亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型使得纈氨酸的生成量增加，纈氨酸作為頭孢菌素C合成的前體物質(zhì),，參與頭孢菌素C母核的合成,，所以亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型可以提高頭孢菌素C的發(fā)酵產(chǎn)量。一般來(lái)說(shuō),，氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷不適合工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的要求,，將這種氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型和生產(chǎn)菌株(或另一種營(yíng)養(yǎng)缺陷型)雜交或者回復(fù)突變，可能得到適合于工業(yè)生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株,。因?yàn)檫@樣的雜交后代或回復(fù)突變株,，可能既保留了營(yíng)養(yǎng)缺陷型的代謝優(yōu)點(diǎn)(生成較多的抗生素前體)，又便于發(fā)酵生產(chǎn)的控制(不需要另外補(bǔ)充相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)),。而且,，還可能通過(guò)雜交或回復(fù)突變獲得具有和抗生素合成有關(guān)的基因的部分二倍體。
　　篩選滲漏缺陷型是一種值得重視的方法,。所謂滲漏缺陷型(leaky mutant)是遺傳性障礙不完全的營(yíng)養(yǎng)缺陷型,。突變使某一種酶的活性下降而不是完全喪失，所以這種缺陷型能夠少量地合成某一代謝產(chǎn)物,，能在基本培養(yǎng)基上少量地生長(zhǎng),。由于滲漏缺陷型不會(huì)合成過(guò)多的終產(chǎn)物，所以不會(huì)造成反饋調(diào)節(jié)而影響中間代謝物的積累。大多數(shù)抗生素高產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)速率低于野生型菌株的生長(zhǎng)速率,，似乎可以認(rèn)為它們?cè)谀撤N意義上屬于滲漏缺陷型,，生長(zhǎng)速率降低可能有利于抗生素合成。一般文獻(xiàn)中采用上標(biāo)“-”表示營(yíng)養(yǎng)缺陷型,，上標(biāo)“L”表示滲漏缺陷型,，例如：Met-+ ThrL表示甲硫氨酸缺陷和蘇氨酸滲漏。
　　根據(jù)以上的推理,，可設(shè)計(jì)如下篩選過(guò)程：先進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn),，選出對(duì)抗生素發(fā)酵產(chǎn)量有明顯影響的初級(jí)代謝產(chǎn)物，據(jù)此誘變出相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型,，然后再誘發(fā)回復(fù)突變或?qū)⒁吧途暾T變成另一營(yíng)養(yǎng)缺陷型,，再與之雜交。如欲篩選滲漏缺陷型,，則把營(yíng)養(yǎng)缺陷型接種在基本培養(yǎng)基上,，這上面出現(xiàn)的菌落是回復(fù)突變株，其中長(zhǎng)得特別小的菌落可能是滲漏缺陷型,。
　　(b) 篩選負(fù)變株的回復(fù)突變株,。選擇經(jīng)過(guò)誘變處理后抗生素生產(chǎn)能力明顯降低或完全喪失，但其他性狀仍近于正常的突變株作為實(shí)驗(yàn)材料,，進(jìn)行誘變,，再挑選高產(chǎn)菌株。因?yàn)閮纱握T變都作用于和抗生素生物合成有關(guān)的基因上,，動(dòng)搖了抗生素合成的遺傳基礎(chǔ),。用此方法得到的突變株，其與抗生素合成有關(guān)的酶受調(diào)節(jié)的程度,，往往低于原出發(fā)菌株,。此外，從負(fù)變株中篩選回復(fù)突變株也比較容易,，因?yàn)樨?fù)變株沒(méi)有發(fā)酵產(chǎn)量或發(fā)酵產(chǎn)量很低，便于從中檢出有較高抗生素產(chǎn)量的回復(fù)突變株,。
　　(c) 篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株,。磷酸鹽對(duì)許多抗生素的生物合成有抑制作用，篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株對(duì)于生產(chǎn)抗生素是很有意義的,。因?yàn)橐岣呖股氐漠a(chǎn)量,，既要使生產(chǎn)菌生長(zhǎng)到一定的量，又要使產(chǎn)生較多的抗生素,。這樣培養(yǎng)基中必須加入一定量的磷酸鹽,，以供菌體生長(zhǎng)的需要，但菌體生長(zhǎng)所需要的磷酸鹽濃度往往對(duì)抗生素有抑制作用，去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株可消除或減弱這種抑制作用以獲得高產(chǎn),。
　　篩選能在磷酸鹽抑制濃度條件下,，正常產(chǎn)生抗生素的突變株的過(guò)程：將孢子懸浮液誘變處理后，將孢子接種于完全培養(yǎng)基上,，使突變株得以表達(dá),，再把完全培養(yǎng)基上的菌落影印接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(含正常濃度的磷酸鹽、加瓊脂),，待菌落長(zhǎng)出后,，用打孔器把長(zhǎng)有單個(gè)菌落的瓊脂塊轉(zhuǎn)移到一張浸有高濃度磷酸鹽的濾紙上培養(yǎng)、發(fā)酵,，然后進(jìn)行生物測(cè)定,。抑菌活力(抑菌圈直徑／菌落直徑)明顯大于其他菌落的可能就是去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株，從影印平板挑取相應(yīng)的菌落,，搖瓶發(fā)酵測(cè)定抗生素產(chǎn)量,。
　　篩選磷酸鹽結(jié)構(gòu)類似物(如砷酸鹽、釩酸鹽)抗性突變株的過(guò)程：磷酸鹽結(jié)構(gòu)類似物對(duì)菌體結(jié)構(gòu)具有毒性,，其抗性菌株可能對(duì)磷酸鹽調(diào)節(jié)不敏感,。例如，釩酸鈉是一種ATP酶的抑制劑,，粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)細(xì)胞內(nèi)有兩種磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)：一是低親和力的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Ⅰ,，一是高親和力的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Ⅱ。釩酸鈉抗性突變株,，缺失磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Ⅱ,，因而避免了過(guò)多地吸收釩酸鈉而導(dǎo)致菌的死亡，同時(shí)也避免了過(guò)多地吸收磷酸鹽而導(dǎo)致磷酸鹽抑制,。
　　(d) 篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株,。能被菌快速利用的碳源在被快速分解利用時(shí)，往往對(duì)許多其他代謝途徑中的酶(包括許多抗生素合成酶和其他的酶)有阻遏或抑制作用,，成為抗生素發(fā)酵產(chǎn)量的限制因素,，不利于發(fā)酵生產(chǎn)工藝的控制。篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株,，對(duì)于提高抗生素發(fā)酵產(chǎn)量,，簡(jiǎn)化發(fā)酵生產(chǎn)工藝具有重要意義?？股厣a(chǎn)中最常見(jiàn)的碳源分解代謝調(diào)節(jié)是“葡萄糖效應(yīng)”,，葡萄糖被快速分解代謝所積累的分解代謝產(chǎn)物在抑制抗生素合成的同時(shí)也抑制其他某些碳、氮源的分解利用,。因此,，可以利用這些碳(或氮)源作為惟一可供菌利用的碳(或氮)源,，進(jìn)行抗葡萄糖分解代謝調(diào)節(jié)突變株的篩選。例如,，將菌在含有葡萄糖(阻遏性碳源)和組氨酸為惟一氮源的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代后,，可選出去葡萄糖分解代謝調(diào)節(jié)突變株。正常的組氨酸分解酶類是被葡萄糖分解代謝物阻遏的,，如果突變株能在這種培養(yǎng)基中生長(zhǎng),，說(shuō)明它具有能分解組氨酸而獲得氮源的酶。這樣的結(jié)果,，可有兩種解釋：一是組氨酸分解酶發(fā)生了突變,，不再受到原有的分解代謝物阻遏；二是葡萄糖分解代謝有關(guān)的酶發(fā)生了突變,，不再產(chǎn)生或積累那么多的分解代謝阻遏物,。第二種解釋符合許多去葡萄糖分解代謝調(diào)節(jié)突變株的特性，因?yàn)橥瑫r(shí)有許多酶(受分解代謝調(diào)節(jié)的酶)的生成都不再受到葡萄糖分解代謝物阻遏,。這種現(xiàn)象也是在抗生素育種工作中選擇這種方法篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株的依據(jù),。
　　葡萄糖的（毒性）結(jié)構(gòu)類似物也可用于篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株。例如,，以半乳糖作為可供菌生長(zhǎng)利用的惟一碳源,，再于培養(yǎng)基中添加葡萄糖的結(jié)構(gòu)類似物，該結(jié)構(gòu)類似物不能為菌所利用,，但可抑制菌利用半乳糖,。所以，在這種培養(yǎng)條件下,，只有去葡萄糖分解代謝調(diào)節(jié)突變株能夠利用半乳糖進(jìn)行生長(zhǎng),，原始菌株由于不能利用半乳糖而不能生長(zhǎng)。因而可選出去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株,。篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株還應(yīng)注意避免走向另一個(gè)極端,，即片面追求葡萄糖分解代謝速率下降，因?yàn)楸３趾线m的葡萄糖分解代謝速率是抗生素高產(chǎn)的關(guān)鍵,。

圖4-7　葡萄糖的（毒性）結(jié)構(gòu)類似物
　　此外,，篩選淀粉酶活性高的突變株，以利于在發(fā)酵培養(yǎng)基中增加淀粉類物質(zhì)作為補(bǔ)充碳源,，也可以減弱碳分解代謝調(diào)節(jié)對(duì)抗生素生產(chǎn)的抑制作用,。
　　(e) 篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株。許多抗生素和氨基酸有共同的前體或者有些氨基酸本身可以作為某些抗生素的前體,。因此,，氨基酸的代謝和抗生素合成有著密切的聯(lián)系,，打破菌的氨基酸代謝的調(diào)節(jié),，可能導(dǎo)致抗生素高產(chǎn)。
　　在培養(yǎng)基中加入氨基酸結(jié)構(gòu)類似物，氨基酸結(jié)構(gòu)類似物對(duì)菌的生長(zhǎng)有抑制作用,，因此可以篩選到解除了氨基酸反饋調(diào)節(jié)的突變株,。這些突變株能夠在含有氨基酸結(jié)構(gòu)類似物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，抗性的機(jī)制可能在于生成較多的氨基酸,，從而提高抗生素前體的量,。例如，在青霉素生物合成途徑中,，半胱氨酸和纈氨酸是青霉素母核的前體,，篩選抗半胱氨酸結(jié)構(gòu)類似物或抗纈氨酸結(jié)構(gòu)類似物的抗性突變株，可能提高半胱氨酸或纈氨酸的生成量,，進(jìn)而提高青霉素產(chǎn)量,。又如賴氨酸和青霉素有共同的中間代謝產(chǎn)物α-氨基己二酸，篩選賴氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株,，可以解除賴氨酸對(duì)α-氨基己二酸生成的反饋調(diào)節(jié),，使α-氨基己二酸生成量增加而促進(jìn)青霉素合成。
　　篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株的方法：將菌種誘變處理,，接種于含抑制濃度的氨基酸結(jié)構(gòu)類似物的培養(yǎng)基中,，由于此種培養(yǎng)條件使得正常菌株不能生長(zhǎng)，而抗氨基酸反饋調(diào)節(jié)的突變株或其他抗性突變株能夠生長(zhǎng),，因此可篩選出氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株,。在實(shí)際操作過(guò)程中，有許多氨基酸結(jié)構(gòu)類似物并不抑制菌的生長(zhǎng),，或只有在高濃度時(shí)才抑制菌的生長(zhǎng),。因此要選擇合適的氨基酸結(jié)構(gòu)類似物用于篩選。還有一些氨基酸結(jié)構(gòu)類似物僅抑制菌落的生長(zhǎng)和減少孢子的數(shù)量,，且高濃度都不抑制菌落形成和孢子形成,，在此情況下，正常大小或正常產(chǎn)孢子的菌落被視為抗性菌,。還可以用加入抗代謝抑制劑(如多烯類抗生素)方法,，使細(xì)胞膜透性增加而提高篩選效果。
　　(f) 篩選二價(jià)金屬離子抗性突變株,。加入能和產(chǎn)物(抗生素)或其中間體結(jié)合的生長(zhǎng)抑制劑(二價(jià)金屬離子),，抑制劑達(dá)到一定濃度，抗生素低產(chǎn)菌株不能生長(zhǎng)而高產(chǎn)菌株能夠幸存下來(lái),，因而可能篩選到高產(chǎn)菌株,。抗性的機(jī)制為形成大量產(chǎn)物或中間體和二價(jià)金屬離子結(jié)合以解除二價(jià)金屬離子對(duì)生產(chǎn)菌的毒性,。但是用此方法,，細(xì)胞膜透性降低而對(duì)二價(jià)金屬離子具有抗性的菌株也會(huì)存留下來(lái),，需要進(jìn)一步進(jìn)行搖瓶篩選，通過(guò)抗生素產(chǎn)量的比較去除那些并不高產(chǎn)的抗性突變株,。
　　采用上述方法篩選出青霉素和桿菌肽等抗生素的高產(chǎn)菌株,。桿菌肽能和二價(jià)金屬離子結(jié)合，具有輸送二價(jià)金屬離子進(jìn)出細(xì)胞的生理功能,。選育桿菌肽高產(chǎn)菌株時(shí),，于培養(yǎng)基中添加適量的硫酸亞鐵，在此條件下篩選到的抗性菌株多數(shù)表現(xiàn)出高產(chǎn)的特性,，其可能的抗性機(jī)理是：生產(chǎn)菌形成大量的桿菌肽和二價(jià)鐵離子結(jié)合,，將二價(jià)鐵離子送出細(xì)胞外，從而避免了二價(jià)鐵離子對(duì)生產(chǎn)菌的毒性作用,。
　　(g) 篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株,。前體或前體結(jié)構(gòu)類似物對(duì)某些抗生素產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)有抑制作用，且可抑制或促進(jìn)抗生素的生物合成,。篩選對(duì)前體或前體結(jié)構(gòu)類似物的抗性突變株,，可以消除前體結(jié)構(gòu)類似物對(duì)生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)及其抗生素合成的抑制作用，提高抗生素產(chǎn)量,。例如,，灰黃霉素發(fā)酵使用氯化物為前體，篩選抗氯化物的突變株,，提高了灰黃毒素的產(chǎn)量,；以苯氧乙酸為青霉素前體，選用抗苯氧乙酸突變株,，提高了青霉素V的發(fā)酵產(chǎn)量,；以青霉素的前體纈氨酸、α-氨基己二酸或半胱氨酸,、纈氨酸的結(jié)構(gòu)類似物,，篩選抗性菌株，提高了青霉素的發(fā)酵產(chǎn)量,。
　　依據(jù)前體特性的不同,，篩選抗性突變株的增產(chǎn)機(jī)理也有所不同。第一類前體是產(chǎn)生菌不能合成或很少合成的化合物,，這一類前體通常需要人為地添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中以促進(jìn)提高抗生素產(chǎn)量或提高抗生素某一組分的產(chǎn)量,。例如青霉素側(cè)鏈前體苯氧乙酸、苯乙酸等,，這一類前體通常對(duì)產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)具有毒性作用,。對(duì)這些前體具有抗性的高產(chǎn)菌株可以通過(guò)高活性的酰基轉(zhuǎn)移酶將前體摻入青霉素分子的側(cè)鏈中,，以合成青霉素,，并解除前體對(duì)產(chǎn)生菌的毒性,，使產(chǎn)生菌在高濃度的毒性前體存在時(shí)也能生長(zhǎng)。篩選這一類前體的抗性突變株,，應(yīng)注意避免那些由于細(xì)胞膜透性下降使前體吸收減少的低產(chǎn)突變株或那些由于加強(qiáng)了對(duì)前體氧化分解的低產(chǎn)突變株。第二類前體是產(chǎn)生菌能夠合成但不能大量積累的初級(jí)代謝中間產(chǎn)物,，發(fā)酵生產(chǎn)中需要在發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)充這一類前體以提高抗生素產(chǎn)量,。例如紅霉素發(fā)酵生產(chǎn)中添加丙醇以提高發(fā)酵產(chǎn)量。這一類物質(zhì)過(guò)多會(huì)干擾產(chǎn)生菌的初級(jí)代謝而抑制菌的生長(zhǎng),?？剐跃甑脑霎a(chǎn)機(jī)理可能在于迅速將丙酸衍生物合成為紅霉素，從而避免丙酸衍生物對(duì)初級(jí)代謝的干擾作用,。第三類前體是初級(jí)代謝終產(chǎn)物,，這一類前體一般對(duì)自身的抗生素合成有反饋調(diào)節(jié)作用，因而難以在細(xì)胞內(nèi)大量積累,。例如青霉素發(fā)酵生產(chǎn)中纈氨酸反饋抑制乙酰羥酸合成酶,，從而抑制了纈氨酸的合成。篩選纈氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株,，可使乙酰羥酸合成酶對(duì)纈氨酸的反饋抑制的敏感性減弱,，促使細(xì)胞的內(nèi)源纈氨酸的濃度增加而提高青霉素產(chǎn)量。
　　(h) 篩選自身所產(chǎn)的抗生素抗性突變株,。某些抗生素產(chǎn)生菌的不同生產(chǎn)能力的菌株,，對(duì)其自身所產(chǎn)的抗生素的耐受能力不同，高產(chǎn)菌株的耐受能力大于低產(chǎn)菌株,。因此,，可用自產(chǎn)的抗生素來(lái)篩選高產(chǎn)菌株。例如有人把金霉素產(chǎn)生菌多次移種到金霉素濃度不斷提高的培養(yǎng)基中去,，最后獲得一株提高生產(chǎn)能力4倍的突變株,。此方法在抗生素高產(chǎn)菌株選育中有廣泛應(yīng)用，青霉素,、鏈霉素,、慶大霉素等抗生素的產(chǎn)生菌均有用此方法來(lái)提高產(chǎn)量的例子。此方法還適用于進(jìn)一步純化高產(chǎn)菌株,。
　　用于菌種理性化篩選的還有各種類型的突變株,，如組成型突變株、消除無(wú)益組分的突變株,、能有效利用廉價(jià)碳源或氮源的突變株,、細(xì)胞形態(tài)改變更有利于分離提取工藝的突變株、抗噬菌體的突變株等等,。這些突變株均有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,，而且這些篩選目標(biāo)雖然不以產(chǎn)量為惟一目標(biāo),，但突變株所具有的優(yōu)良特性卻往往能導(dǎo)致產(chǎn)量的提高。例如紅霉素生產(chǎn)中的抗噬菌體菌種,，其紅霉素產(chǎn)量表現(xiàn)出較大的變異范圍,，得到比原種產(chǎn)量高的突變株。這可能是由于發(fā)生了抗噬菌體突變后,，動(dòng)搖了菌種原有的遺傳基礎(chǔ),，使之更容易獲得高產(chǎn)突變株。
　?、?突變基因的表現(xiàn)
　　菌種的發(fā)酵產(chǎn)量決定于菌種的遺傳特性和菌種的培養(yǎng)條件,。突變株的遺傳特性改變了，其培養(yǎng)條件也應(yīng)該作出相應(yīng)的改變,。在菌種選育過(guò)程的每個(gè)階段,，都需不斷改進(jìn)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以鑒別帶有新特點(diǎn)的突變株,，尋找符合生產(chǎn)上某些特殊要求的菌株,。高產(chǎn)菌株被篩選出來(lái)以后，要進(jìn)行最佳發(fā)酵條件的研究,，使高產(chǎn)基因能在生產(chǎn)規(guī)模上得以表達(dá),。例如，誘變處理四環(huán)素產(chǎn)生菌得到的突變株,，在原培養(yǎng)基上與出發(fā)菌株相比較,，發(fā)酵單位的提高并不明顯，但是在原培養(yǎng)基配方中增加碳,、氮濃度,，調(diào)整磷的濃度，該菌株就表現(xiàn)出代謝速度快,、發(fā)酵產(chǎn)量高的特性,。用該菌株進(jìn)行生產(chǎn)，并采用通氨補(bǔ)料的工藝來(lái)適應(yīng)該突變株代謝速度快的特點(diǎn),，使產(chǎn)量有了新的突破,。