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多肽藥物的研究與開發(fā)將作為二十一世紀(jì)高新技術(shù)竟?fàn)幍闹饕椖恐?。生物活性多肽在?nèi)源性物質(zhì)中占有非常重要的地位,，除酶、受體,、金屬蛋白等生物大分子外,，許多合成或分離的多肽對生理過程或病理過程，對疾病的發(fā)生,、發(fā)展或治療過程有重要意義。
氨基酸彼此以酰胺鍵（也稱肽鍵）相互連接的化合物稱作肽,。一種肽含有的氨基酸少于10個就稱作寡肽,，超過的就稱為多肽,。多肽與蛋白質(zhì)只有肽鏈長短之別，二者間并沒有嚴(yán)格的區(qū)分,。蛋白質(zhì)是生命存在的最基本形式,。可見多肽是生命之"橋",，蛋白質(zhì)工程從某種意義上而言就是研究多肽,。
伴隨著分子生學(xué)物、生物化學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,，多肽研究取得了驚人的,、劃時代的飛躍。人們發(fā)現(xiàn)存在于生物體的多肽有數(shù)萬種,，并且發(fā)現(xiàn)所有的細(xì)胞均能合成多肽,。同時，幾乎所有的細(xì)胞也都受多肽調(diào)節(jié),，它涉及激素,、神經(jīng)、細(xì)胞生長與生殖等各個領(lǐng)域,，21世紀(jì)是一個多肽的世界,，人們研究多肽，也渴望著將多肽應(yīng)用到醫(yī)療,、保健,、檢測等多個領(lǐng)域中去，為人類造福,。
事實上,，肽類藥物開發(fā)與應(yīng)用已走出科學(xué)家們的實驗室，變成了現(xiàn)實,，并發(fā)揮著其獨(dú)特的功效,。例如，神經(jīng)緊張肽（NT）能降低血壓,，對腸和子宮具有收縮作用,；內(nèi)啡肽和腦啡肽的衍生物有著很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用；促甲狀腺素釋放激素（TRH）是一種能促進(jìn)產(chǎn)婦乳汁分泌的多肽,；能治療糖尿病,、胃潰瘍、胰腺炎的多肽是一種環(huán)狀的14肽,；臨床上常用的催產(chǎn)素是一種多肽,；已獲廣泛應(yīng)用的白蛋白多肽、胸腺肽,、血清胸腺因子（FTS）等均可以引起免疫T細(xì)胞的分化,；近日來在中國及日本已開始使用的糖肽輔助治療腫瘤,，其作用機(jī)理是使淋巴系統(tǒng)活化等等。應(yīng)用多肽技術(shù)開發(fā)的醫(yī)用蛋白質(zhì)芯片（肽芯片）只有指甲蓋大小,，放置了與腎炎,、胃潰瘍和胃癌等相關(guān)的抗原分子，只要通過芯片閱讀儀便可檢測到有關(guān)疾病的功能狀態(tài)與變異情況,。其功能已相當(dāng)于一個大型或中型實驗室,、化驗室，效率是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)檢測的成百上千倍,，受檢者幾乎沒有任何痛苦,。肽芯片的廣泛應(yīng)用，已在醫(yī)學(xué)臨床檢測業(yè)引發(fā)一場技術(shù)革命,。
自從1963年MERRIFIELD發(fā)展成功了固相多肽合成（SPPS）方法以來,，經(jīng)過不斷的改進(jìn)和完善,，到今天這個方法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個常用技術(shù),，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無法比擬的優(yōu)點(diǎn),。
固相合成的主要設(shè)計思想是：先將所要合成肽鏈的未端氨基酸的羧基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上,。氨基酸作為氨基組分經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基,，并同過量的活化羥基組分反應(yīng)接長肽鏈。重復(fù)（縮合—洗滌—去保護(hù)—中和和洗滌—下一輪縮合）操作,，達(dá)到所要合成的肽鏈長度,；最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理,，即得所要的多肽,。
多肽合成概述與原理
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多肽化學(xué)合成概述
多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)。它是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物,由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成,。到現(xiàn)在,，人們已發(fā)現(xiàn)和分離出一百多種存在于人體的肽，對于多肽的研究和利用,，出現(xiàn)了一個空前的繁榮景象,。多肽的合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應(yīng)用價值,。通過多肽合成可以驗證新的多肽結(jié)構(gòu)；設(shè)計新的多肽,，用于研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,；為多肽生物合成反應(yīng)機(jī)制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽藥物等,。
1963年，R.B.Merrifield創(chuàng)立了將多肽羧基端的氨基酸固定在不溶性樹脂上,，然后在此樹脂上依次偶聯(lián)氨基酸，延長肽鏈,、合成多肽的固相合成法,，在固相法中，每步反應(yīng)后只需簡單地洗滌樹脂,，便可達(dá)到純化目的,。克服了經(jīng)典液相合成法中的每一步產(chǎn)物都需純化的困難,，為多肽的自動化合成奠定了基礎(chǔ)。為此,，Merrifield獲得1984年諾貝爾化學(xué)獎。
Merrifield所建立的Boc合成法是采用TFA(三氟乙酸)可脫除的Boc（叔丁氧羰基）為α-氨基保護(hù)基,，側(cè)鏈保護(hù)采用芐醇類,。合成時將一個Boc－氨基酸衍生物共價交聯(lián)到樹脂上,，用TFA脫除Boc,，用三乙胺中和游離的氨基末端，然后通過DCC活化,、偶聯(lián)下一個氨基酸,，最終脫保護(hù)多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法。用Boc法已成功地合成了許多生物大分子,，如活性酶,、生長因子、人工蛋白等,。
在Boc合成法中,，反復(fù)地用酸來脫保護(hù)，這種處理帶來了一些問題：如在肽與樹脂的接頭處,，當(dāng)每次用50%TFA脫Boc基時，有約1.4%的肽從樹脂上脫落,，合成的肽鏈越長,，這樣的損失越嚴(yán)重；此外,，酸處理會引起側(cè)鏈的一些副反應(yīng),，Boc合成法尤其不適于合成含有色氨酸等對酸不穩(wěn)定的肽類,。1978年，Chang,、Meienlofer和Atherton等人采用Carpino報道的Fmoc（9-芴甲氧羰基）基團(tuán)作為α-氨基保護(hù)基,，成功地進(jìn)行了多肽的Fmoc固相合成,。Fmoc法與Boc法的根本區(qū)別在于采用了堿可脫除的Fmoc為α-氨基的保護(hù)基,，側(cè)鏈的保護(hù)采用TFA可脫除的叔丁氧基等，樹脂采用90%TFA可切除的對烷氧芐醇型樹脂,，最終的脫保護(hù)避免了強(qiáng)酸處理,。
自Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來,，經(jīng)過不斷的改進(jìn)和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個常用技術(shù),，表現(xiàn)出了液相合成法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。近幾十年來,，固相法合成多肽更以其省時,、省力,、省料、便于計算機(jī)控制,、便于普及推廣的突出優(yōu)勢而成為多肽合成的常規(guī)方法。以Boc和Fmoc兩種方法為基礎(chǔ)的各種多肽自動合成儀也相繼出現(xiàn),，并仍在不斷得到發(fā)展和完善,。
固相合成的基本原理
多肽合成是一個重復(fù)添加氨基酸的過程,，固相合成順序一般從C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。過去的多肽合成是在溶液中進(jìn)行的稱為液相合成法,，現(xiàn)在多采用固相合成法,，從而大大的減輕了每步產(chǎn)品純化的難度,。為了防止副反應(yīng)的發(fā)生，參加反應(yīng)的氨基酸的側(cè)鏈都是被保護(hù)的,；而羧基端是游離的，并且在反應(yīng)之前必須活化,?；瘜W(xué)合成方法有兩種，即Fmoc和tBoc,。由于Fmoc比tBoc存在很多優(yōu)勢，現(xiàn)在大多采用Fmoc法合成,，如圖：
每個循環(huán)由以下三步反應(yīng)構(gòu)成，反復(fù)循環(huán)直到肽鏈延伸至所需長度時即可完成,。
1. 脫保護(hù)：Fmoc保護(hù)的氨基酸必須用一種堿性溶劑（piperidine）去除氨基的保護(hù)基團(tuán),。
2. 活化：待連接的氨基酸的羧基被活化劑所活化。
3. 偶聯(lián)：活化的羧基與前一個氨基酸裸露的氨基反應(yīng),，形成肽鍵,。在此步驟使用過量的試劑促使反應(yīng)完成,。
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多肽合成的常見問題
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問：多肽的兩端應(yīng)如何處理？是保持自由狀態(tài)還是屏蔽起來,？
答：多肽是用來模擬蛋白的,，為了模仿蛋白的表現(xiàn)，我們需要合成與蛋白有相似的結(jié)構(gòu)和電荷的多肽,。當(dāng)一條肽段從一個蛋白中“切出”之后,，兩端的電荷數(shù)將與基因體蛋白有差異。我們需要改變合成策略來使他們一致,。 總體而言： 如果是出自蛋白C端的序列,，通過乙酰化將N端屏蔽,； 如果是出自蛋白N端的序列,，通過酰胺化將C端屏蔽； 如果是出自蛋白中間部分,，用乙?；王０坊瘜啥硕计帘巍?nbsp;
問：如果我的肽純度是95%,，那么,，其余的5%都是些什么物質(zhì)？
答：多肽的純度通常是通過HPLC,，用每分鐘1%的標(biāo)準(zhǔn)乙晴梯度來檢測決定的,。合成過程中，氨基酸之間的交聯(lián)效率不是總能達(dá)到100%,，因而產(chǎn)生一系列的氨基酸缺失的雜質(zhì),。大多數(shù)這樣的氨基酸缺失的雜質(zhì)在純化過程中都被去掉了，但有少數(shù)的雜質(zhì)其色譜表現(xiàn)與目標(biāo)多肽很相近,。這些氨基酸缺失的雜質(zhì)肽留在了多肽樣品中就構(gòu)成了余下的幾個百分點(diǎn),。
問：如何重新溶解多肽？
答：多肽的溶解與多肽的序列相關(guān),，首先試蒸餾水和超聲（1-10MG/ML）,，如果不溶，計算肽中的堿性殘基（Lys,Arg,His和自由氨基端）和酸性殘基（Gly,Asp和自由羧基端）的數(shù)目,。如果堿性基團(tuán)偏多,，可以滴加1N的醋酸，直到溶解為止,，如果酸性基團(tuán)居多,，滴加1N的氨水，直到溶解為止,。如果在實驗中需要用緩沖液,，建議在多肽完全溶解之前不要加入鹽,，因為鹽會使肽的溶解度降低。如果上述溶液中肽都不溶,，可以試試用少量有機(jī)溶劑如DMSO,，乙晴或DMF。
問：什么是多肽的凈含量,，它的意義是什么,？
答：干品多肽的重量中不僅僅包含多肽，還包含有一些非肽的組份,，如水,，被吸收的溶劑、配位離子和鹽等,。肽的凈含量是指肽在其中的重量百分比,，這個百分比的數(shù)值范圍很大，可能從50%到90%,，取決于純度,、序列以及合成和純化的方法，不要將肽的凈含量和肽的純度混為一談,，它們是完全不同的兩個概念,。純度通常是由HPLC決定的。純度定義的是多肽樣品中含正確序列的組分的百分比,，而肽的凈含量是指樣品中肽類物質(zhì)相對于非肽類物質(zhì)所占的百分比,，肽的凈含量通常是用氨基酸組分分析或紫外分光法測定的。這個信息主要是在一些對肽的濃度很敏感的實驗中,，對計算肽的濃度是很重要的,。
問：對不同的實驗,，如何選擇肽的純度,？
答：肽的純度是很重要的指標(biāo)，純度的選擇取決于實驗的目的,。對不太靈敏的篩選實驗,，建議使用粗品或>75%，對免疫級別,，建議選用>85%,。對于受體與LIGAND相互作用的研究，生物ASSAY研究,，或細(xì)胞水平的研究,，建議>95%，對于結(jié)構(gòu)研究,，建議>98%,。
問：如何保存多肽,？
答：在可能的情況下，應(yīng)該盡量將多肽以凍干粉的形式在-20℃下保存,，這樣會在幾年內(nèi)避免細(xì)菌的降解,，二級結(jié)構(gòu)的形成、氧化或其他修飾的發(fā)生,。多肽在溶液中的穩(wěn)定性要差一些,，所以強(qiáng)烈建議使用滅菌水或滅菌過濾的方式進(jìn)行溶解，如果序列中有Cys,Met或Trp等殘基,，用無氧的溶劑進(jìn)行溶解以避免氧化,。使用冷凍的溶液時，建議將溶液進(jìn)行分裝,，以避免多次的溶解和冷凍對多肽造成的損害,。pH的推薦范圍是3-6之間。使用前應(yīng)保證包裝容器和所裝物品回溫到室溫,，以避免吸水,。多肽溶液最好即配即用，使用過程中將肽溶液保持在低溫但不結(jié)凍的狀態(tài)下,。長期保存（3個月到5年）：凍干粉,，在-20℃下冷凍干燥保存；中期保存（0-3個月）：-20℃冷凍液體或凍干粉冷藏,；短期保存（<1周）：冷藏的液體或凍干粉,。
問：常見的是用什么方法生產(chǎn)多肽？
答：線性多肽肽鏈的延伸采用Fmoc固相合成法,，由C端到N端逐步依次將氨基酸連接上,。開始，將第一個氨基酸通過一段對酸敏感的連接物連接在不溶性的支撐物樹脂上,。用六氫吡啶將Fmoc保護(hù)基去掉后,，第二個Fmoc保護(hù)的氨基酸被連接了上去，連接方法有預(yù)活化或“一鍋煮”等,。目標(biāo)序列連接完畢后,，用TFA將肽鏈從樹脂上洗脫得到粗品。
多肽的溶解與保存
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建議先用少量肽來試驗最適溶解方法,，只有當(dāng)多肽完全溶解后,，才能加入溶液并將之稀釋至最終濃度。即先溶解,，后加入緩沖液,。注意：總是將多肽加入到適當(dāng)溶劑中攪拌，而不能采用其它方式。
凍干多肽的溶解
多肽溶解中的主要問題是二級結(jié)構(gòu)的形成,。
雖然疏水肽鏈二級結(jié)構(gòu)的形成更明顯,，但除了最短的肽鏈外，該現(xiàn)象發(fā)生在幾乎所有肽鏈,，與極性無關(guān),。因此，溶解多肽的第一個原則是用無菌的蒸餾水或去離子水（如果條件允許則用無氧水）,。
多肽溶液可能遇到細(xì)菌降解,。為避免該現(xiàn)象的發(fā)生，多肽應(yīng)溶解在無菌的蒸餾水中,，或者用0.45或0.2µm孔徑的濾膜過濾除菌,。
包含Cys、Met,、Trp的多肽特別容易氧化,，因此應(yīng)該溶于無氧的水中。無氧水可以通過注入惰性氣體（氮,、氦,、氬）減壓除氣得到。
若多肽不溶于純水,，超聲處理有助于打碎顆粒并增加溶解度,。注意：超聲處理會引起溶液發(fā)熱和多肽降解。
若多肽中包含多個堿性氨基酸,，使用1~10%的乙酸水溶液,；對于疏水性非常強(qiáng)的多肽，則使用50%乙酸,。
若多肽中含有大量酸性氨基酸,，可用1~10%氨溶液或乙酸乙基嗎啡或重碳酸鹽等揮發(fā)性的堿性緩沖液溶解。pH值在層析前必須調(diào)整,。
異丙醇和乙腈能溶解中等大小的肽,。若肽要上柱，有機(jī)溶劑的量則必須很少,，否則將嚴(yán)重影響滯留時間,。
若多肽因為含有Val,、Leu,、Met、Phe,、Tyr,、Ala等芳烴側(cè)鏈而高度疏水，或為中性肽時,，DMF或DMSO等膜變性劑的使用,，有助于多肽的溶解,。
a. 高濃度膜變性劑通過破壞多肽的二級結(jié)構(gòu)而助溶。
b. 膜變性劑適于多肽分析液的制備,，但可能會對其生物活性的研究工作造成干擾,。
c. DMF是最佳變性劑（最高濃度可達(dá)30%），滴加至多肽溶解,。
d. 反相層析時,，DMF將與洗脫液前峰一起流出，依進(jìn)樣量的多少,，峰值可能很高,。大多數(shù)肽能在大量DMF流出后幾分鐘內(nèi)流出，若肽鏈很小,，洗脫太早,，多肽的量將降低。
凍干多肽的保存
所有標(biāo)明“保持凍干”的產(chǎn)物,，都必須保存在冰凍條件下,，最好-20℃，若保存在-10℃以下,，大多數(shù)肽可維持幾年的活性,。
當(dāng)使用冰凍產(chǎn)品時，開蓋之前,，瓶或試管應(yīng)在裝有新鮮干燥劑的干燥箱內(nèi)升至室溫,。對于保存于-20℃的產(chǎn)品，這個過程需要一小時或更長,，隨包裝大小而異,。否則，當(dāng)瓶打開時,，水氣進(jìn)入導(dǎo)致多肽凝縮而降低其穩(wěn)定性,。一旦打開，應(yīng)迅速稱量完畢,，并立即密閉以免潮解,，尤其親水肽更應(yīng)注意。
多肽溶液的保存
多肽溶液比干粉的穩(wěn)定性差很多,，為了得到最好結(jié)果,，遵循下列原則：
反復(fù)凍融有損于肽的活性，所以建議分裝成小包裝保存,。需要多少解凍多少,，用后棄掉剩余物。
溶于pH5~7無菌的緩沖液中，貯存于-20℃,。
包含Cys,、Met、Try,、Glu,、Asp的多肽易于氧化，因此須保存在無氧化劑的環(huán)境中,。
由于細(xì)菌能降解多肽,，因此貯存前必須過濾除菌。
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肽鏈設(shè)計
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簡介
多肽是復(fù)雜的大分子,，因此每條序列在物理和化學(xué)特性上都是獨(dú)特的,。有些多肽合成很困難，另有些多肽雖然合成相對容易,，但純化困難,。最常見的問題是許多肽不溶于水溶液，因此在純化中,，這些疏水肽必須溶于非水溶劑中,，或特殊的緩沖液，而這些溶劑或緩沖液很可能不適合應(yīng)用于生物實驗系統(tǒng),，因此研究人員不能使用該肽達(dá)到自己的目的,，因此下面是對于研究人員設(shè)計多肽的一些建議。
合成困難肽的選擇
1. 減少序列長度
由于肽的長度增加導(dǎo)致粗產(chǎn)物純度降低,，小于15個殘基的肽能較容易得到,。當(dāng)肽鏈長度增加到20個殘基以上時，正確產(chǎn)物的量就是一個主要考慮的問題,。在許多實驗中,，降低殘基數(shù)低于20往往能得到更好的結(jié)果。
2. 減少疏水殘基數(shù)
疏水殘基占明顯優(yōu)勢的肽,，尤其在距C端7~12個殘基的區(qū)域,，常常引起合成困難。這通常被認(rèn)為是由于合成中形成β折疊片,，這樣產(chǎn)生不完全偶聯(lián),。在這些例子中，用一個或幾個極性殘基置換,，或加入Gly或Pro以打開肽結(jié)構(gòu)可能會有幫助,。
3. 減少“困難”殘基
有多個Cys、Met,、Arg,、Try殘基通常難于合成,。Ser通?？勺鳛镃ys的非氧化替換,。
改善可溶性的選擇
1. 改變N端或C端
對于酸性肽（即pH值為7時帶負(fù)電荷），我們推薦乙?；∟端乙?；珻端保持自由羧基）,，以增加負(fù)電荷,。而對于堿性肽（即pH值為7時帶正電荷），我們推薦酰氨化（N端自由氨基,，C端酰氨化）,，以增加正電荷。
2. 縮短或加長序列
某些序列含有大量疏水氨基酸,，如Trp,、Phe、Val,、Ile,、Leu、Met,、Tyr和Ala等,，當(dāng)這些疏水殘基大于50%通常難于溶解。為了增加肽的極性,，加長序列可能會有幫助,。另外一種選擇是通過減少疏水殘基的方法降低肽鏈的長度以增加極性。肽鏈極性越高,，就越有可能溶于水,。
3. 加入可溶性殘基
對于某些肽鏈而言，加上一些極性氨基酸能改善可溶性,。我們推薦給酸性肽的N端或C端加上Glu-Glu,。給堿性肽的N端或C端加上Lys-Lys。如果不能加入帶電荷基團(tuán),，可以將Ser-Gly-Ser加到N端或C端,。但是，肽鏈的兩端不能改變時,，該方法則不可行,。
4. 通過置換一個或多個殘基改變序列
肽鏈的可溶性可通過改變序列內(nèi)某些殘基來改善。通常單個殘基的替換就能顯著改善其疏水性,，而這種改變通常是較為保守的,，如用Gly代替Ala,。
5. 通過選用不同“框架”來改變序列
如果能用某個序列來制備許多長度一定的相互串連或重疊的多肽，則可以用改變各個多肽起始點(diǎn)的方法來實現(xiàn)改變序列的目的,。其原理是：在同一多肽的親水和疏水殘基間創(chuàng)造新的更好的平衡,，或?qū)⑼欢嚯膬?nèi)的“困難”殘基（比如2個Cys）放進(jìn)兩個不同的多肽而不是集于同一分子內(nèi)。
特殊氨基酸殘基對肽鏈特性影響的一些要點(diǎn)
對于由遺傳密碼編碼的二十種氨基酸及蛋白質(zhì)中常見的其他氨基酸,，按其特性可以用幾種方法進(jìn)行分類,。下面列出了最常見的氨基酸的三字母代碼和單字母代碼，以及不同的分類方法,。
氨基酸的代碼
丙氨酸 Ala A 甲硫氨酸 Met M
半胱氨酸 Cys C 天門冬酰胺 Asn N
天門冬氨酸 Asp D 脯氨酸 Pro P
谷氨酸 Glu E 谷氨酰胺 Gln Q
苯丙氨酸 Phe F 精氨酸 Arg R
甘氨酸 Gly G 絲氨酸 Ser S
組氨酸 His H 蘇氨酸 Thr T
異亮氨酸 Ile I 纈氨酸 Val V
賴氨酸 Lys K 色氨酸 Trp W
亮氨酸 Leu L 酪氨酸 Tyr Y
蛋白質(zhì)中常見的其他氨基酸
羥脯氨酸
胱氨酸
焦谷氨酸
肽鏈設(shè)計中常見的其它氨基酸
α-氨基丁酸（Cys的置換物）
β-氨基丙氨酸（Ala的直鏈異構(gòu)物）
正亮氨酸（亮氨酸的線性側(cè)鏈異構(gòu)物）
氨基酸按其親水性,、疏水性可分為
親水性氨基酸：D，E,，H,，K，Q,，R,，S，T,，羥脯氨酸,，焦谷氨酸
疏水性氨基酸：A，F(xiàn),，I,，L，M,，P,，V，W,，Y,，α-氨基丁酸，β-氨基丙氨酸,，正亮氨酸
C和G屬于未定類
其它的分類方法
在溫和條件下氧化的氨基酸：C,，M
脫氨或脫羧基的氨基酸：N，Q
蛋白制備中易降解的氨基酸：M,，W
帶正電荷的氨基酸：K,，R，H
帶負(fù)電荷的氨基酸：D,，E
當(dāng)下列疏水氨基酸,，即Ala，Val,，Leu,，Ile,，Pro，Met,，Phe,，Trp存在于C端時，通常引起合成及純化的困難,，這主要是因為它們難溶于水,。
如果您看見這些氨基酸,，即Cys,、His、Pro普遍存在于序列中或在C端時,，則在常規(guī)的固相合成中需要特殊的固相支持物,。在用普通的固相支持物時，在二肽階段,，由于環(huán)化引起的損失非常高,。在許多例子中，甚至導(dǎo)致所有鏈從固相支持物上損失,，但是若C端為酰氨化Pro時,，或者用特殊的PEG-聚苯乙烯固相支持物時，能使產(chǎn)量大為提高,，則不會發(fā)生這種現(xiàn)象,。
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抗原多肽設(shè)計的基本原則
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為了使產(chǎn)生的抗體獲得最佳效果，仔細(xì)地設(shè)計抗原多肽是很有必要的,，設(shè)計應(yīng)滿足一個基本條件：在免疫過程中,，該抗原既不會產(chǎn)生過強(qiáng)的免疫反應(yīng)，同時又能產(chǎn)生出對感興趣的蛋白有結(jié)合能力的抗體,?？乖O(shè)計是一個很復(fù)雜的課題，有諸多需要注意的細(xì)節(jié),。根據(jù)我們所積累的經(jīng)驗,，有幾點(diǎn)關(guān)鍵的基本設(shè)計原則可供大家參考：
確定抗體的用途
新開展一個研究項目，弄清楚所感興趣的蛋白的一些基本特性是很有必要的,，特別是如果知道蛋白的結(jié)構(gòu)會對選擇抗體易于接觸和識別的區(qū)域有很大的幫助,。然而，在沒有這樣精確的結(jié)構(gòu)信息的情況下,，了解研究的用途會影響多肽設(shè)計的策略,。例如：如果研究重點(diǎn)是集中在蛋白的不同區(qū)域，如C端或N端,，或在一種特定狀態(tài)下的蛋白,，如磷酸化等,，那么按照所需序列設(shè)計的多肽和產(chǎn)生的相應(yīng)的抗體在應(yīng)用上應(yīng)該沒有太大的困難，然而,，蛋白的構(gòu)象將影響抗體與其識別區(qū)域之間的相互作用,。這種情況下可能存在的問題是如果在折疊的蛋白中，該識別區(qū)域被藏在蛋白的內(nèi)部,，抗體將無法接觸到該區(qū)域,，則無法產(chǎn)生相互作用。
識別區(qū)域的選擇原則
一般說來最理想的抗原識別區(qū)域應(yīng)具備親水,、位于蛋白表面和結(jié)構(gòu)上易變形性等特點(diǎn),。因為在大多數(shù)的天然環(huán)境中，親水區(qū)域傾向于集中在蛋白表面,，而疏水區(qū)域常常被包裹在蛋白內(nèi)部,，同樣道理，抗體只能與在蛋白表面發(fā)現(xiàn)的識別區(qū)域相互作用,，而當(dāng)這些識別區(qū)域有足夠的結(jié)構(gòu)易變形性而轉(zhuǎn)移到抗體可接觸的位置時,，將會與抗體間有很高的親和性。
連續(xù)的與不連續(xù)的識別區(qū)域
連續(xù)的區(qū)域是指由連續(xù)的氨基酸序列構(gòu)成的識別區(qū)域,。大多數(shù)抗體是針對連續(xù)識別區(qū)域的,，抗體能與這類區(qū)域以很高的親和力相結(jié)合表明這段序列不在蛋白內(nèi)部。不連續(xù)的識別區(qū)域是代表有一定折疊的一段多肽序列,，或是將兩段分離開的多肽連在一起的抗體的識別區(qū)域,。在某些情況下，針對這樣不連續(xù)識別區(qū)域的抗體也能產(chǎn)生,，只是用來免疫的抗原多肽必須具備與該不連續(xù)識別區(qū)域相似的二級結(jié)構(gòu),，而序列的長度需要符合相關(guān)的要求。
基本建議
為了避免識別區(qū)域隱藏在蛋白內(nèi)部的風(fēng)險,，我們通常建議選擇蛋白的N,，C兩端來產(chǎn)生的相應(yīng)的抗體。因為在完整的蛋白中,，N,，C兩端通常是暴露在蛋白表面的。然而,，一定要注意膜蛋白的C端疏水性太強(qiáng),，不適合作為抗原。
序列的長度
通常我們建議抗原多肽的序列長度在8-20個氨基酸殘基之間,，如果太短,，就有多肽特異性不強(qiáng)、所產(chǎn)生的抗體與天然蛋白之間的結(jié)合能力不夠強(qiáng)的風(fēng)險,；但是,，如果序列長度超過20,，將有可能引入二級結(jié)構(gòu)，所產(chǎn)生的抗體失去特異性的可能,，而且肽鏈越長,，通常合成難度增大，不易獲得高純度的產(chǎn)品,。
載體蛋白交聯(lián)的選擇
將載體蛋白加在遠(yuǎn)離抗體識別區(qū)域的一端,，在序列中沒有Cys的情況下在N或C端加上Cys為交聯(lián)的首選方法。
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