比較項目

DNA粗提取與鑒定

血紅蛋白的提取和分離

實驗方法

鹽析法,、酒精沉淀法和顯色法

凝膠色譜法和電泳法

實驗原理

1.DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同（如圖）：

在2mol/LNaCl溶液中，DNA溶解,，部分蛋白質(zhì)鹽析生成沉淀,，過濾可除去部分蛋白質(zhì)；在0.14mol/LNaCl溶液中時,，DNA析出,，過濾可除去部分蛋白質(zhì)。

2.DNA不溶于酒精溶液,，但是細胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精,。利用這一原理可將DNA與蛋白質(zhì)進一步分離。

3.利用DNA遇二苯胺（沸水?。┏伤{色的特性,，可以鑒定提取的DNA

1. 凝膠色譜法是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部,，通過的路程短,，移動速度快；相對分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)分子比較容易進入凝膠內(nèi)的通道,，通過的路程長,，移動速度慢,。因此，樣品中相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)先流出,，相對分子質(zhì)量小的分子后流出,。因此得以分離。

2. 電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程,。許多重要的生物大分子,，如氨基酸、多肽,、蛋白質(zhì),、核苷酸、核酸等都具有可解離基團,，它們在某個特定的pH下會帶上正電或負電,；在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極方向移動,。電泳技術(shù)就是在電場的作用下,，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異,，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,，從而達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的的,。

實驗步驟

1.實驗材料的選取

一定要選取DNA含量較高的生物材料,，否則會由于實驗過程中或多或少的損失而造成檢測的困難。實驗中一般選用雞血或菜花作為實驗材料,，不選擇哺乳動物的血細胞,，因為其紅細胞無核，很難提取到DNA,。

2.破碎細胞,，獲取含DNA的濾液

以動物細胞為實驗材料時，破碎細胞較容易,，例如,，在雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒攪拌,，過濾后收集濾液即可,。以植物細胞為材料時，充分研磨破壞了細胞壁,，洗滌劑中的表面活性劑成分能夠與膜蛋白結(jié)合從而破壞細胞膜,，這些為核DNA的釋放提供了通道。同時要加入食鹽使DNA溶解，便于提取,。

3.去除濾液中的雜質(zhì)

根據(jù)DNA的溶解特性、對酶及高溫的耐受性的不同等特性,，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開,。

（1）利用DNA在不同NaCl溶液中溶解度不同，通過控制NaCl溶液的濃度去除雜質(zhì),。

（2）直接在濾液中加入嫩肉粉,，使嫩肉粉中的木瓜蛋白酶分解蛋白質(zhì)。

（3）將濾液放入60℃～75℃的恒溫水浴箱中保溫10～15min,，注意嚴格控制溫度,。

4.DNA的析出與鑒定

在濾液中加入冷卻的無水乙醇，并用玻璃棒沿一個方向輕輕攪拌,，由于 DNA不溶于酒精,，會出現(xiàn)乳白色絲狀物，用玻璃棒將絲狀物卷起,，并用濾紙吸去表面的水分,。

兩支試管中各加入2mol/L的NaCl溶液5mL，將絲狀物放入其中一支試管中,，攪拌使其充分溶解后,，向兩支試管中分別加入4mL 二苯胺試劑，混勻后沸水溶中加熱5min,，待試管冷卻后,，比較兩試管的顏色變化，將發(fā)現(xiàn)加入DNA的試管中的溶液呈藍色,，從而鑒定DNA的存在,。

血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理,、粗分離,、純化和純度鑒定。

1.樣品處理

（1）紅細胞的洗滌,。洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白,。采用低速短時間離心，吸出上層透明的黃色液體,，再加入五倍體積的生理鹽水,，重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色,，表明紅細胞已洗滌干凈,。

（2）血紅蛋白的釋放。紅細胞在蒸餾水和40%的甲苯作用下破裂，釋放血紅蛋白,。（3）分離血紅蛋白溶液,。將混合液進行離心后會分層，第3層的紅色透明液體是血紅蛋白,。

2.粗分離——透析　目的是除去樣品中的分子量較小的雜質(zhì),。

3.純化——凝膠色譜操作

（1）凝膠色譜柱的制作

（2）凝膠色譜柱的裝填

①裝填前，凝膠用蒸餾水或者洗脫液充分溶脹,。

②凝膠裝填要均勻,，色譜柱內(nèi)不能有氣泡，一旦發(fā)現(xiàn)有,，必須重裝,。

③裝填完后，立即用300 ml 20 mmol/L的磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12 h,，使凝膠裝填緊密,。

（3）樣品的加入和洗脫

①按正確方法加樣，不能破壞凝膠面,。

②進行洗脫時,，等紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，采用試管收集,。

4.純度鑒定——SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(選做)

SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量,是根據(jù)大多數(shù)蛋白質(zhì)都能與陽離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)按重量比結(jié)合成復(fù)合物,使蛋白質(zhì)分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白質(zhì)分子的負電荷,，消除了不同蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng),使蛋白質(zhì)分子相對遷移率的大小完全取決于分子量的高低，因此可從已知分子量的標準蛋白質(zhì)的對數(shù)和相對遷移率所作的標準曲線中求出供試品的分子量,。

操作關(guān)鍵

（1）制備雞血細胞液時,，要在取新鮮雞血的同時加入抗凝劑，使血液分層,，取下層血細胞沉淀,。

（2）獲取較多DNA的關(guān)鍵是向雞血細胞液加入足量的蒸餾水，以便使細胞膜和核膜破裂,，核內(nèi)物質(zhì)釋放出來,。

（3）實驗中共有3次過濾。過濾時使用的紗布層數(shù)與取其濾液或黏稠物有關(guān),。第1,、3次要取其濾液，使用的紗布為1—2層,，第2次是要取其濾出的黏稠物,，使用的紗布為多層。

（4）實驗中有6次攪拌,，除最后一次攪拌外,，前5次攪拌要朝向一個方向，并且在析出DNA，DNA再溶解和提取中,，各步攪拌都要輕緩,，玻璃棒不要直插燒杯底部，防止DNA分子斷裂,。

（5）實驗中有兩次使用蒸餾水,。一次在第1步，加水是為了使血細胞吸水膨脹破裂,，加水后必須充分攪拌,，不應(yīng)少于5min,，使血細胞充分破裂,；第二次加蒸餾水是在第3步，加水是為了稀釋氯化鈉溶液,。

（6）實驗中有三次加氯化鈉溶液,。在步驟2中，當加入氯化鈉后,，必須充分晃動燒杯,，使二者混合均勻，加速染色質(zhì)中DNA與蛋白質(zhì)分離,，使DNA充分游離,，并溶解在氯化鈉溶液中。在步驟5中,，加氯化鈉溶液也是為了DNA的再溶解,，不過這時溶液中蛋白質(zhì)含量已很少。在步驟8中,，加的NaCl溶液的濃度比前2次低的多,，但還是為溶解DNA。

（7）DNA進一步提純時選用預(yù)冷95%的酒精作用是抑制核酸水解酶活性,，防止DNA講解,；降低分子運動，易于形成沉淀,；低溫有利于增加DNA柔韌性,，減少斷裂。

（8）本實驗成功的關(guān)鍵,，是保證提取到足量且較純凈的DNA,。因為DNA在細胞中含量少，所以在下列步驟中應(yīng)特別注意：在步驟1中使用的雞血的量要在180mL左右,。提取細胞核物質(zhì)時要充分攪拌5min以上,。在步驟2中要充分晃動燒杯，在步驟3中加蒸餾水要控制好量，同時應(yīng)用玻璃棒緩緩攪動使DNA聚集其上,。在第4步中要使用多層紗布過濾,，在第5步中要充分攪伴，在第7步中使用冷酒精,。因為DNA易吸附在玻璃容器上,，所以實驗中最好使用塑料燒杯和試管，以減少DNA的損失,。

（9）盛放雞血細胞液的容器和實驗中的燒杯和試管最好也是塑料制的,，因為玻璃制品表面帶電荷，DNA中的磷酸基帶相反的電荷,，會被吸附于玻璃表面,，減少DNA含量。

（10）二苯胺實際要現(xiàn)用現(xiàn)配,，否則會影響鑒定效果,。

1.洗滌紅細胞時，洗滌次數(shù)過少,，無法去除血漿蛋白,；離心速度過高和時間過高會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，達不到分離的效果,。

2.商品凝膠是干燥的顆粒,，使用前需要放在洗脫液中膨脹，為了加速膨脹,，可以加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱,，逐漸升溫接近至沸騰，通常需1～2h,。這種方法不但節(jié)約時間,，而且可以除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內(nèi)空氣,。

3.凝膠色譜柱的裝填是分離關(guān)鍵之一,，裝填時要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙,。裝填時不能有氣泡,，氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果,。裝填后不能發(fā)生洗脫液流干,，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦出現(xiàn)上述現(xiàn)象都需重填,。如果凝膠色譜柱裝填得很成功,、分離操作也正確的話,，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄,、平整,，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲,、散亂,、變寬，說明分離的效果不好,，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān),。

4.分離蛋白質(zhì)時，要求各種蛋白質(zhì)同時從相同起點開始分離,，在凝膠色譜操作中加樣時要保證分離樣品進入凝膠層后再接通洗脫液,，開始洗脫。在電泳操作中,，通過濃縮膠的作用,，將樣品濃縮后再進入分離膠分離,。

5.滴加樣品時,，吸管關(guān)口貼管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面,。

比較項目

體內(nèi)復(fù)制

PCR反應(yīng)

解旋

在解旋酶作用下,，細胞提供能量，部分DNA雙鏈解開

80～100℃高溫解旋DNA雙鏈全部解開,，不需要解旋酶

酶

DNA解旋酶,、DNA聚合酶、DNA連接酶

TaqDNA聚合酶

引物

一小段RNA

可以是RNA或單鏈DNA分子片段

合成子鏈

在引物基礎(chǔ)上,，一條鏈連續(xù)合成,；另一條鏈不連續(xù)合成。再由DNA連接酶連接

分別從兩條鏈的引物端開始,，都是連續(xù)合成

溫度

體內(nèi)溫和條件

高溫

特點

邊解旋邊復(fù)制  半保留復(fù)制

體外快速擴增

循環(huán)次數(shù)

受生物體自身控制

30多次

產(chǎn)物

完整DNA

引物之間DNA片段

相同點

都需要提供DNA模板,；以4種脫氧核苷酸(dNTP)為原料；都需要在一定緩沖溶液中進行,；子鏈延伸的方向都是從5′→3′方向

項目

PCR操作

用具

微量離心管,、微量移液器、DNA擴增儀（熱循環(huán)儀）,、臺式高速離心機 ,、一次性槍頭、紫外分光光度計

步驟

（1）準備：按照PCR反應(yīng)體系配方將所需試劑擺放到實驗桌上

（2）移液：用微量移液器按照配方在微量離心管加入各組分

（3）混合：蓋嚴離心管蓋子,，防止脫落或液體外濺,，并用手指輕彈管壁,，使反應(yīng)液混合均勻。

（4）離心：將微量離心管放在離心機上,，離心約10s,，目的使反應(yīng)液集中在離心管底部，提高反應(yīng)效率,。

（5）反應(yīng)：將離心管放入PCR儀中,，設(shè)置程序進行反應(yīng)。

（6）測定：用紫外光光度計測定DNA在260nm紫外線的光吸收值,，計算DNA的含量,。

過程

其原理與細胞內(nèi)DNA復(fù)制相似,但反應(yīng)體系較簡單，其基本過程為：①變性：通過加熱至95℃左右,，使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,，形成單鏈DNA，作為反應(yīng)的模板,。②退火（復(fù)性）：將溫度降至引物的50℃左右或以下,，引物與DNA模扳互補區(qū)域結(jié)合，形成雜交鏈,。③延伸： 當反應(yīng)體系溫度升至72℃左右時,，DNA聚合酶催化以引物為起始點的5ˊ→3ˊDNA鏈延伸反應(yīng)，形成新生DNA鏈,。以上三步為一個循環(huán),，每一個循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板,如此循環(huán)30次，介于兩個引物之間的DNA片段呈指數(shù)擴增,。

結(jié)果

(1)DNA擴增的理論數(shù)值

①開始有1條模板,，則復(fù)制n次有2ⁿ條

②開始有m條模板，則復(fù)制n次有m×2ⁿ條

（2）計算DNA含量,。公式：DNA含量(g)=50×（260nm的讀數(shù)）×稀釋倍數(shù),。

成功關(guān)鍵

（1）為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管,、槍頭,、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓蒸氣滅菌。

（2）在微量離心管中添加反應(yīng)成分時,，每吸取一種試劑后,，移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入后,，蓋嚴離心管口的蓋子,，用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻,，再將微量離心臂放在離心機上,，離心約10s,，使反應(yīng)液集中在離心管底部，再放入PCR儀中  進行反應(yīng),。

有關(guān)問題

1.DNA復(fù)制需要引物的原因：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,，而只能從

3′端延伸DNA鏈。

2.當PCR體系的溫度有變性后快速冷卻到50℃左右時,，引物與模板可結(jié)合,，一般不需考慮解開的兩個DNA鏈的重新結(jié)合，原因是：

（1）模板DNA比引物長得多,，而且復(fù)雜得多,，不易重新結(jié)合。

（2）引物和模板之間的碰撞機會遠遠高于模板互補鏈之間碰撞,。

（3）加入的引物的量足夠大而模板鏈數(shù)量少,。