關(guān)于實(shí)驗(yàn)小編也是初來乍到,，今天先和大家探討最常見的轉(zhuǎn)錄組測序后的驗(yàn)證方法。轉(zhuǎn)錄組的驗(yàn)證方法有點(diǎn)多（如表達(dá)量驗(yàn)證,、亞細(xì)胞定位,、RNA結(jié)合蛋白、功能獲得驗(yàn)證,、功能缺失驗(yàn)證等）,，本篇只先介紹表達(dá)量驗(yàn)證,、RNA結(jié)合蛋白、亞細(xì)胞定位,，其余的下期見,！

表達(dá)量驗(yàn)證

一般情況我們優(yōu)先選擇高表達(dá)量的RNA，以及差異表達(dá)明顯的RNA去驗(yàn)證,。去驗(yàn)證某個(gè)基因或者RNA的表達(dá)量時(shí),，需要保證沒有基因組DNA的污染。PS:如果是非編碼RNA驗(yàn)證,，由于他們可能不含polyA尾巴,，所以要注意反轉(zhuǎn)錄方式。

設(shè)計(jì)引物RNA進(jìn)行qRT-PCR,。

哈哈哈,，如果你和小編一樣曾是生信dog，我相信你一定一臉懵逼,，我連PCR到底是啥能干啥都不知道,，你跟我說qRT-PCR!

小編以一個(gè)實(shí)驗(yàn)編外人士跟你通俗易懂的科普一下，PCR是設(shè)計(jì)引物判斷某個(gè)DNA序列是否存在的技術(shù),；RT-PCR對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（Reverse transcription）得到cDNA后,，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，進(jìn)而判斷某個(gè)RNA序列是否存在的技術(shù),；qPCR不只判斷DNA是否存在,，還能判斷含量高低，qRT-PCR即quatitative RT-PCR,，是判斷RNA是否存在以及含量高低的技術(shù),！

總結(jié)一句話，PCR都得設(shè)計(jì)引物,，帶RT就是研究RNA,不帶RT就是研究DNA,，帶q就是定量，不帶q就是定性,！至于他是咋定量的呢，劃重點(diǎn),，靠內(nèi)參?。?/span>

小編已經(jīng)快被自己總結(jié)能力所折服了,！

Northern blot 首先通過電泳的方法將不同的RNA分子依據(jù)其分子量大小加以區(qū)分,，然后通過與特定基因互補(bǔ)配對的探針雜交來檢測目的片段。PS: Northern blot樣品需除去RNA酶,。

小編再給大家科普一下下,，Western Blot做蛋白,，Southern Blot做DNA，Eastern blotting是Western Blot的變形也是作蛋白,，不過沒得到廣泛認(rèn)可,。

靈敏度：qRT-PCR > Northern blot

特異性：Northern blot > qRT-PCR

RNA和蛋白互作驗(yàn)證

RNA結(jié)合蛋白（RNA Binding Protein）是一類伴隨RNA的調(diào)控代謝過程，與RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的總稱,。RBP伴隨RNA生命始終,，其主要作用是介導(dǎo)RNA的成熟、轉(zhuǎn)運(yùn),、定位和翻譯,；一個(gè)RBP可能存在多種靶標(biāo)RNA；且其表達(dá)缺陷會造成多種疾病,。RNA與蛋白相互作用是RNA功能研究的焦點(diǎn)問題之一,。

已知RNA，尋找結(jié)合蛋白,。

RNA pull-down實(shí)驗(yàn)就是先將RNA進(jìn)行標(biāo)記（如生物素探針標(biāo)記）再與蛋白共同孵育,，從而形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),，最后通過WB(western blot)或質(zhì)譜（mass Spectrometry）檢測蛋白質(zhì),。

該技術(shù)用于尋找與目的RNA結(jié)合的蛋白。

已知蛋白,，尋找RNA,。

RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀）技術(shù)采用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來,，經(jīng)分離純化對RNA進(jìn)行分析,。

該技術(shù)用于尋找與目的蛋白結(jié)合的RNA。

已知RNA,已知蛋白,，判斷是否結(jié)合,。

EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay，凝膠遷移）技術(shù)是通過凝膠電泳遷移檢測蛋白-RNA互作的一種技術(shù),。

首先將設(shè)計(jì)好的帶有標(biāo)記的RNA探針與樣本蛋白混合孵育,，形成蛋白-RNA復(fù)合物。因復(fù)合物分子量大,，會在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)遷移較慢,，而沒有結(jié)合蛋白的探針則較快。利用非變性聚丙烯酰胺凝膠分離,，來確定RNA結(jié)合蛋白的特異性,。

該技術(shù)用于體外驗(yàn)證預(yù)測的RNA與蛋白之間是否能夠結(jié)合。

亞細(xì)胞定位研究

亞細(xì)胞定位是指某種蛋白或表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位，例如在核內(nèi),、胞質(zhì)內(nèi)或者細(xì)胞膜上存在,。越來越多的證據(jù)顯示，在生物學(xué)過程中位于不同的亞細(xì)胞器RNA擁有不同的功能,，亞細(xì)胞定位有利于更深入地了解RNA的生物功能,。

RNAFISH，即RNA的免疫熒光原位雜交,，是將已標(biāo)記的RNA探針（可在探針上標(biāo)記熒光基團(tuán),、生物素、地高辛等）與組織切片或細(xì)胞中的待測RNA中的互補(bǔ)序列雜交,從而對組織細(xì)胞中的RNA進(jìn)行定性,、定位和相對定量分析,。

小編偷偷的告訴你（雖然有可能你早就知道），RNALocate數(shù)據(jù)庫（http://www./rnalocate）收錄了超過42,000個(gè)人工收集的RNA的亞細(xì)胞定位信息,，包含超過23,100個(gè)RNA,，在65個(gè)物種中的42個(gè)亞細(xì)胞定位。lncATLAS數(shù)據(jù)庫（http://lncatlas./）則是一個(gè)專門收錄lncRNA亞細(xì)胞定位的數(shù)據(jù)庫,。有需要的可以先去查詢,！

休息休息一下~這一期就到這里吧~

下期關(guān)于轉(zhuǎn)錄組相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證如功能獲得&缺失、細(xì)胞模型&動物模型見,！

參考文獻(xiàn)：

Zhang T , Tan P , Wang L , et al. RNALocate: A resource for RNA subcellular localizations[J]. Nucleic Acids Research, 2016, 45(Database issue).

Mas-Ponte D, Carlevaro-Fita J, Palumbo E, Pulido TH, Guigo R, Johnson R. LncATLAS database for subcellular localization of long noncoding RNAs. Rna. 2017 Jul 1;23(7):1080-7.