一,、滅菌

滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一,。初學(xué)者首先要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體,，接觸自然水源的物體,，至少它的表面都是有菌的,。依此觀點(diǎn)，無菌室等未經(jīng)處理的地方,、超凈臺表面,、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀,、剪在未處理之前,、我們身體的整個外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個消化道,、呼吸道，即我們呼出的氣體,、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的,。

常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，物理方法如干熱（烘燒和灼燒）,、濕熱（常壓或高壓蒸煮）,、射線處理（超聲波、微波）,、過濾,、清洗和大量無菌水沖洗等措施?；瘜W(xué)方法是使用升汞,、甲醛、過氧化氫,、高錳酸鉀,、來蘇兒、漂白粉,、次氯酸鈉,、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理,。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當(dāng)選用,。

1．培養(yǎng)基用濕熱滅菌? 培養(yǎng)基在制備后的24小時內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi),，其中的蒸汽不能外溢,，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高,，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加,。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121℃,。在此蒸汽溫度下,，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢,。

注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣,，滅菌才能徹底,。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣,，使鍋內(nèi)均勻升溫,，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥,，通電后,，待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥,，放出空氣,，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥,。

關(guān)閥再通電后,，壓力表上升達(dá)到0.1MPa時,開始計時，維持壓力0.1～0.15MPa 20分鐘,。

2. 用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌

3．植物材料表面用消毒劑滅菌

從外界或室內(nèi)選取的植物材料,，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養(yǎng)基,，便會造成培養(yǎng)基污染,。因此植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上,，這一過程叫做接種,。接種的植物材料叫做外植體。

首先,，將采來的植物材料除去不用的部分,，將需要的部分仔細(xì)洗干凈，如用適當(dāng)?shù)乃⒆拥人⑾?，硬的材料用刮刀刮,。把材料切割成適當(dāng)大小，即滅菌容器能放入為宜,。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時,，沖洗時間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細(xì)小的材料,，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗,。流水沖洗在污染嚴(yán)重時特別有用。

洗時可加入洗衣粉清洗,，濃度可按100ml 水加半角匙洗衣粉為宜,，大約浸洗5分鐘,，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物,，除去脂質(zhì)性的物質(zhì),，便于滅菌液的直接接觸。當(dāng)然,，最理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)－吐溫,。

第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內(nèi)完成,，準(zhǔn)備好消毒的燒杯,、玻璃棒、70%酒精,、消毒液,、無菌水、手表等,。用70%酒精浸10-30秒。它具有使植物材料表面被浸濕的作用,。70%酒精穿透力強(qiáng),，也很易殺傷植物細(xì)胞，所以浸潤時間不能過長,。有一些特殊的材料,，如果實(shí)、花蕾,、包有苞片,、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等,，以及主要取用內(nèi)部的材料,，也可只用70%酒精處理稍長的時間。處理完的材料在無菌條件下,，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層,，取用內(nèi)部材料。

第三步是用滅菌劑處理,。表面滅菌劑的種類較多,，可根據(jù)情況選取1～2 種使用。

表4－2　常用滅菌劑使用濃度及效果比較表

上述滅菌劑應(yīng)在使用前臨時配制,，氯化汞可短期內(nèi)貯用,。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌，故滅菌時用廣口瓶加蓋較好,；升汞是由重金屬汞離子來達(dá)到滅菌的,；過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌的,，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無菌水涮洗3～4次即可,；而用升汞液滅菌的材料,，因升汞殘毒較難去除，應(yīng)當(dāng)用無菌水涮洗8～10次,，每次不少于3分鐘,，以盡量去除殘毒。

滅菌時,，把瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯或其它器皿中,，記好時間，倒入消毒溶液,，不時用玻璃棒輕輕攪動,，以促進(jìn)材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡,，使消毒徹底,。在快到時間之前1～2分鐘，開始把消毒液傾入一備好的大燒杯內(nèi),，要注意勿使材料倒出,，傾凈后立即倒入無菌水，輕攪涮洗,。滅菌時間是從倒入消毒液開始,，至倒入無菌水時為止。記錄時間還便于比較消毒效果,，以便改正,。滅菌液要充分浸沒材料，寧可多用些滅菌液,，切勿勉強(qiáng)在一個體積偏小的容器中滅菌很多材料,。

二、無菌操作

接種時由于有一個敞口的過程,，所以是極易引起污染的時期,，這一時期主要由空氣中的細(xì)菌和工作人員本身引起，接種室要嚴(yán)格進(jìn)行空間消毒,。接種室內(nèi)保持定期用1-3%的高錳酸鉀溶液對設(shè)備,、墻壁、地板等進(jìn)行擦洗,。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外,，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵迅速沉降。工作人員進(jìn)入接種室前雙手必須進(jìn)行消毒,，先用水和肥皂洗滌,，操作前再用70%酒精擦試，操作時雙手不能隨便接觸未經(jīng)消毒的東西,。入室前穿好滅過菌的專用實(shí)驗(yàn)服,，專用實(shí)驗(yàn)服要經(jīng)常保持清潔并消毒 。頭發(fā)帶的灰塵也很多,，因此應(yīng)戴上實(shí)驗(yàn)用帽,。工作人員的呼吸也是污染的主要途徑，操作規(guī)程過程禁止不必要的談話和咳嗽,。還要盡量減少工作人員在接種室內(nèi)的走動,。

操作期間,盡量把所用的器皿蓋子蓋好。刀,、剪,、鑷子等用具，一般在使用前浸泡在７０％的酒精中,，用時再在火焰上消毒,，待冷卻后使用。每次使用前均需進(jìn)行用具消毒,。工作結(jié)束,，及時取出接種材料，然后清理臺面,，再用５％的來蘇兒或石炭酸全面噴霧或打開紫外線照射半小時,。

三,、接種

接種是將已消毒好的根,、莖、葉等離體器官,，經(jīng)切割或剪裁成小段或小塊,，放入培養(yǎng)基的過程。以上已敘述接種前的材料表面的消毒滅菌,，現(xiàn)將接種前后的程序連貫地介紹一遍,。

(一)將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超凈臺上,，用消毒劑滅菌,，再用無菌水沖洗．最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的４層紗布上或?yàn)V紙上,。

（二）材料吸干后,，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀,，對材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈?。如葉片切成0.5cm見方的小塊,；莖切成含有一個節(jié)的小段。微莖尖要剝成只含1～2片幼葉的莖尖大小等,。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械,，防止交叉污染。

（三）用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上,。具體操作是：先解開包口紙,，將試管幾乎水平拿著，試管口靠近酒精燈焰,，將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動,，讓管口里外灼燒數(shù)秒鐘，若用棉塞蓋口,，可先在管口外面灼燒,，去掉棉塞，再燒管口里面,。然后用鑷子夾取一塊外植體送入試管內(nèi),，輕輕插入培養(yǎng)基上。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上,，以放1～3塊為宜,。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放（尖端向上）其它尚無統(tǒng)一要求,。放置材料數(shù)量現(xiàn)在傾向少放,，人們通過統(tǒng)計認(rèn)為：對外植體每次接種以一支試管放一枚組塊為宜，這樣節(jié)約培養(yǎng)基和人力,，一旦培養(yǎng)物污染可以拋棄,。接完種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘,。若用棉塞,，塞好后，包上包口紙,，包口紙里面也要過火,。

四、培養(yǎng)    指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室（有光照,、溫度條件）里,，使之生長，分裂,、分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程,。