β-內(nèi)酰胺酶及其檢測方法

β-內(nèi)酰胺酶是細菌產(chǎn)生的可水解β-內(nèi)酰胺環(huán)抗生素的酶,。β-內(nèi)酰胺酶（β-lactamase）的產(chǎn)生是細菌對(β內(nèi)酰胺類)抗菌藥物耐藥最常見的機制，,，廣泛地涉及到許多社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌,，在各種耐藥機制中占80%。β-內(nèi)酰胺酶是由多種酶組成的酶家族,，通過水解或非水解方式破壞進入菌體內(nèi)的β-內(nèi)酰胺環(huán),，導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺類抗生素失活，這些酶的基因存在于細菌的染色體或質(zhì)粒中,。它的種類和數(shù)量現(xiàn)已超過了400種,，β-內(nèi)酰胺酶分類比較多而復(fù)雜,，最常用的有兩種，即分子生物學(xué)方法和布氏法,。

其檢測方法包括常規(guī)方法和分子生物學(xué)方法,。前者包括微生物法，碘量法,，紙片酸度定量法,，.產(chǎn)色頭胞菌素法；后者包括轉(zhuǎn)移性分析,，基因分析,，

酶蛋白性質(zhì)分析。

一  β內(nèi)酰胺酶的合成,、定位及傳播方式

β內(nèi)酰胺酶既可以在細菌內(nèi)組成型表達,，如銅綠假單胞菌；又可以由質(zhì)粒介導(dǎo)的誘導(dǎo)表達,，如嗜水氣單胞菌及金黃色葡萄球菌,。而質(zhì)粒介導(dǎo)的方式是細菌耐藥性傳播的一個主要機制，在革蘭氏陰性菌中利用接合的方式進行傳播,，而在革蘭氏陽性菌中利用轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式獲得耐藥性狀,。細菌的這種耐藥性狀的可轉(zhuǎn)移性正是細菌耐藥性爆發(fā)的原因。在革蘭氏陰性菌中,，β內(nèi)酰胺酶象胞外酶一樣被分泌到膜外的環(huán)境,，而在革蘭氏陽性菌中，β內(nèi)酰胺酶在它與受體結(jié)合以攻擊抗生素的之前則停留在周質(zhì)腔中,。

二  β內(nèi)酰胺酶的作用機制

β內(nèi)酰胺酶破壞β內(nèi)酰胺抗生素的β內(nèi)酰胺環(huán)有兩種作用機制,。

第一，絕大多數(shù)常見的β內(nèi)酰胺酶有一個依賴絲氨酸發(fā)揮作用的機制,，并且根據(jù)氨基酸序列組成分為三類（A,，C和D）。通常它們的活性位點具有一個狹窄的縱形溝狀結(jié)構(gòu),，在溝的底部形成了一個空腔（氧陰離子袋）,，這種疏松的構(gòu)造容易彎曲，便于結(jié)合底物,。由于β內(nèi)酰胺環(huán)上的羰基碳在結(jié)合β內(nèi)酰胺酶活性部位的絲氨酸時發(fā)生了不可逆的反應(yīng),，結(jié)果使其成為開環(huán)物，進而重建了β內(nèi)酰胺酶,。這類酶對青霉素,、頭孢菌素、單內(nèi)酰環(huán)類抗生素都有活性。

第二,，是一類不大多見的β內(nèi)酰胺酶,，被稱為金屬類β內(nèi)酰胺酶，或B類β內(nèi)酰胺酶,。它們的特點是利用一個2價金屬離子,，絕大多數(shù)為鋅離子，分別與組氨酸或半胱氨酸結(jié)合,，或同時與二者結(jié)合,，并與β內(nèi)酰胺類抗生素的羰基碳的酰胺鍵相互作用，使其不能發(fā)揮作用,。這類酶主要對青霉素,、頭孢菌素、碳青酶烯類抗生素發(fā)揮作用,，但對單內(nèi)酰環(huán)類抗生素?zé)o效,。

三  β內(nèi)酰胺酶的分類

迄今為止，人們發(fā)現(xiàn)的β內(nèi)酰胺酶的性質(zhì)多種多樣,，從20世紀(jì)60年代后期以來人們做了許多嘗試將其分類,。這些分類方法主要有兩個原則：第一種也是最古老的方法是基于酶的生化及功能特性；第二種方法是基于酶的分子結(jié)構(gòu),。

1.  β內(nèi)酰胺酶的功能學(xué)分類

現(xiàn)有幾種標(biāo)準(zhǔn)來用于β內(nèi)酰胺酶的分類,，包括抗生素的抑菌的作用范圍，β內(nèi)酰胺酶的耐藥范圍,，β內(nèi)酰胺酶的等電點,、最大水解速度、結(jié)合常數(shù),、等電聚焦,、蛋白分子量等方法。

最新的分類方法是Bush于1995年提出,，他將β內(nèi)酰胺酶分為四個大類（1－4）及六個亞類（a－f）,。

第1類為耐頭孢菌素的β內(nèi)酰胺酶，但不被克拉維酸所抑制,，分子生物學(xué)分類屬于C類,。

第2類為耐青霉素酶、耐頭孢菌素酶,，可以被克拉維酸所抑制，分子生物學(xué)分類屬于A和D類,，是由最初的TEM和SHV基因表達的結(jié)果,。但由于表達的β內(nèi)酰胺酶的TEM和SHV基因數(shù)量越來越多，它們首先被分為兩個亞類2a和2b。2a亞類只包括耐青霉素酶,，而2b亞類范圍較廣,，它可以使青霉素、頭孢菌素以同樣速度失活,。進一步的分類都是在2b基礎(chǔ)上劃分的：亞類2be,，字母e代表廣譜酶活性，即ESBLs,，可以使第三代頭孢菌素（頭孢他啶,、頭孢噻肟、頭孢泊肟）失活,，還可以使單內(nèi)酰環(huán)類抗生素（氨曲南）失活,；亞類2br，字母r表示減少與克拉維酸及舒巴坦的結(jié)合,，所以也被稱為TEM基因表達的有抗性的抑制劑,，可是它們依然對他佐巴坦敏感。隨后又分出4個亞類,，亞類2c是對羧芐青霉素效果比對青霉素要好,，而且對氯唑西林有一定的作用。亞類2d的酶對氯唑西林耐藥效果比對青霉素要好,，對羧芐青霉素有一定的作用,；這些酶很少被克拉維酸所抑制，并且這些酶中的一部分成為ESBLs,。亞類2e的這些酶是耐頭孢菌素酶,，但同樣可以水解單內(nèi)酰環(huán)類抗生素，也可以被克拉維酸所抑制,。亞類2f被加上是因為它們是依賴絲氨酸發(fā)揮作用的耐碳青酶烯酶,，與第3類中的依賴鋅離子發(fā)揮作用的耐碳青酶烯酶形成對比。

第3類是依賴鋅離子或金屬離子的β內(nèi)酰胺酶,，分子生物學(xué)分類屬于B類,。它們是唯一的在鋅離子或金屬離子輔助下發(fā)揮作用的酶。它們可以水解青霉素,、頭孢菌素,、碳青酶烯抗生素。這樣,，碳青酶烯抗生素既可以被亞類2f酶(絲氨酸作用機制)抑制,，又可以第3類酶（鋅離子作用機制）所抑制。

第4類酶是不能被克拉維酸所抑制的耐青霉素酶,，但目前在分子生物學(xué)上沒有分類,。

2  β內(nèi)酰胺酶的分子生物學(xué)分類

β內(nèi)酰胺酶的分子生物學(xué)分類方法是基于核酸及氨基酸的序列的差異,。迄今為止，人們已經(jīng)確認了四種類型的β內(nèi)酰胺酶（A,、B,、C、D）,，相對應(yīng)的功能學(xué)上分類如前所述,。其中A類、C類和D類β內(nèi)酰胺酶是依賴絲氨酸發(fā)揮作用,，而B類β內(nèi)酰胺酶是依賴鋅離子或金屬離子輔助下發(fā)揮作用的酶,。

A類酶包括多種質(zhì)粒編碼的青霉素酶，活性部位為絲氨酸殘基,，分子量為29kDa,；

B類酶為金屬酶，由染色體或質(zhì)粒編碼,，酶活性需鋅離子參與,，可被乙二胺四乙酸（EDTA）抑制；

C類酶的活性部位為絲氨酸殘基,，分子量為39 kDa,，其產(chǎn)生與誘導(dǎo)劑有關(guān)；

D類酶又稱為OXA型（水解苯唑西林）β-內(nèi)酰胺酶,。

四  β內(nèi)酰胺酶的檢測方法

1.常規(guī)方法

(1).微生物法：

[原理] 以一種對青霉素高度敏感的細菌-枯草芽孢桿菌作為指示劑,，試驗時如果被測細菌株產(chǎn)生青霉素酶，破壞了青霉素,，則此高度敏感菌株即可生長,，否則，指示劑則被抑制,。

[方法] 以枯草芽孢桿菌為指示菌,，用棉拭子將枯草芽孢桿菌接種于瓊脂培養(yǎng)基上，或傾注方法將枯草芽孢桿菌混于瓊脂平板內(nèi),。然后將被測菌與產(chǎn)青霉素酶陽性及陰性對照菌株,，按下圖接種劃線，在瓊脂培養(yǎng)基中央放置一含青霉素G（1單位）紙片,。放置35℃培養(yǎng)24小時后觀察結(jié)果,。

[結(jié)果判斷] 如被檢菌產(chǎn)生青霉素酶，則沿著被測菌處的枯草芽孢桿菌抑菌環(huán)出現(xiàn)凹痕,。
[應(yīng)用] 生物學(xué)方法是古老的方法,，由于特異性差、靈敏度低,，現(xiàn)在基本上很少被采用,。

(2).碘量法

[原理] β-內(nèi)酰胺酶能裂解青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)形成青霉噻唑酸,，它與淀粉競爭游離碘，破壞了碘和淀粉的蘭色復(fù)合物,，使蘭色變?yōu)闊o色。

[方法]

①將0.25克青霉素溶于41.7mlPH6.0的磷酸鹽緩沖液中,，使其濃度成6000ug/ml,。取0.1ml于一小試管中。

②將培養(yǎng)18-24小時的細菌在含青霉素試管內(nèi)制成濃厚菌懸液（10^9/ ml）,。

③在37℃水浴中放置30分鐘,，不時搖動，使酶能破壞青霉素,。

④加入1%可溶性淀粉溶液0.5 ml,，搖勻。

⑤加入碘液0.02 ml,。

⑥在37℃水浴中放置10分鐘,，觀察結(jié)果。

[結(jié)果] 在10分鐘內(nèi)能使蘭色完全消退的菌株為β-內(nèi)酰胺酶陽性,，不消退者為陰性,。

[注意事項]

①由于青霉素很容易分解，因而用于實驗的青霉素應(yīng)新鮮配制,。

②淀粉也新鮮配制,，在100 ml蒸餾水中加入1克可溶性淀粉，放到開水中水浴直到淀粉溶解,。

③實驗應(yīng)按照步驟操作,，如果碘加得過早，酶反應(yīng)就會停止,，產(chǎn)生假陰性結(jié)果,。

④每次試驗最好用陽性和陰性對照。

[應(yīng)用] 常用于檢測淋病奈瑟氏菌,。

（3）.紙片酸度定量法

[原理] β-內(nèi)酰胺酶能破壞青霉素中的β-內(nèi)酰胺環(huán),，形成青霉噻唑酸，使PH降低,，指示劑溴甲酚紫顏色由紫變黃,。

[方法]

①將一小片Whatman濾紙放于空平皿中。

②讓濾紙吸足青霉素溶液（0.05M磷酸緩沖液,，PH8.0+0.2%溴甲酚紫+5%無緩沖劑的結(jié)晶青霉素）,。

③用接種環(huán)把10-20個菌落涂到濾紙上，

④蓋好平皿后,，將濾紙片在37℃孵育30分鐘,，觀察結(jié)果,。

[結(jié)果] 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株使濾紙顏色由紫色變黃色，一般在10分鐘內(nèi)即能看到,。

[應(yīng)用] 紙片酸度定量法一般用于檢測淋病奈瑟氏菌,、流感嗜血桿菌和葡萄球菌。

（4）.產(chǎn)色頭胞菌素法

[原理] 產(chǎn)色頭胞菌素如頭胞硝噻吩（nitrocefin）的β-內(nèi)酰胺環(huán)能被β-內(nèi)酰胺酶所破壞,，使其顏色由淺黃色變?yōu)榉奂t色,，以此來測定細菌的產(chǎn)酶情況。

[方法] 將頭胞硝噻吩（nitrocefin）紙片置于干凈的平皿內(nèi),，用無菌的牙簽或接種環(huán)挑取細菌菌落涂于紙片上,，觀察紙片有無顏色變化。

[結(jié)果] 紙片涂抹處如顏色由淺黃色變成粉紅色,，表示該菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,，如顏色不變，表示細菌不產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,。

[應(yīng)用] 頭胞硝噻吩（nitrocefin）主要檢測淋病奈瑟氏菌,、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌（布拉漢氏菌）,、葡萄球菌,，結(jié)果可靠。莫拉氏菌（布拉漢氏菌）只能用頭胞硝噻吩（nitrocefin）法,。

（對于淋病奈瑟氏菌,、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌（布拉漢氏菌）快速測定β-內(nèi)酰胺酶比做藥敏試驗?zāi)芨斓氐玫脚R床需要的結(jié)果,。β-內(nèi)酰胺酶試驗還可驗證葡萄球菌對紙片法青霉素的敏感試驗結(jié)果是否可信,。腸桿菌科、假單胞菌科及其它需氧革蘭氏陰性桿菌不必測定β-內(nèi)酰胺酶,，因其結(jié)果常常不能預(yù)測這類細菌對臨床常用來治療β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物的敏感性,。）

2.分子生物學(xué)方法

1．酶蛋白性質(zhì)分析：包括表型分析和酶動力學(xué)分析。

耐藥表型分析：紙片藥敏試驗和E-試驗測定MICs

提取酶粗提物進行a.三相水解試驗,。

b.等電聚焦電泳,。

c.酶動力學(xué)分析。

2．基因分析：基因型別分類,、測序,、分析其結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因。

a.PCR擴增及PCR產(chǎn)物測序,。

b.PCR擴增整合子全可變區(qū),，分析其中結(jié)構(gòu)和可能的β-內(nèi)酰胺酶基因。

c.鳥槍法克隆可表達的β-內(nèi)酰胺酶基因,，分析基因結(jié)構(gòu),。

3．轉(zhuǎn)移性分析：分析酶編碼基因位于質(zhì)粒上還是染色體上,，在不在整合子中。

A,。質(zhì)粒：

a.質(zhì)粒接合試驗,。

b.轉(zhuǎn)化試驗：電轉(zhuǎn)化、鈣轉(zhuǎn)化或MgCl2轉(zhuǎn)化

B,。整合子：PCR擴增整合子全可變區(qū)及PCR產(chǎn)物序列測定,。

另外，基因芯片可用于病原微生物耐藥基因的表達譜檢測,、突變分析、多態(tài)性的測定,。病原體的耐藥基因的檢測可通過兩種方式：表達譜芯片檢測藥物誘導(dǎo)的基因表達改變來分析其耐藥性,；寡核苷酸芯片檢測基因組序列的亞型或突變位點從而分析其耐藥性。

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