Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,，然后利用抗體進(jìn)行檢測。對已知表達(dá)蛋白,，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測,，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測,。
本文主要通過以下幾個方面來詳細(xì)地介紹一下Western Blot技術(shù):
一,、原理
二、 分類
i.放射自顯影
ii.底物化學(xué)發(fā)光ECL
ECF
iv.底物DAB呈色
三,、 主要試劑
四,、 主要步驟
五、 實(shí)驗常見的問題指南
1.參考書推薦
2.針對樣品的常見問題
3.抗體
4.濾紙,、膠和膜的問題
5.Marker的相關(guān)疑問
6.染色的選擇
7.參照的疑問
8.緩沖液配方的常見問題
9.條件的摸索
10.方法的介紹
11.結(jié)果分析

一,、 原理
與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,，被檢測物是蛋白質(zhì),，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗,。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì),，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變,。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá),。

二,、分類

現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色,，體同水平和實(shí)驗條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL,。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行,，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾,，如遇到HRP,，即發(fā)光，可使膠片曝光,，就可洗出條帶,。 

三、主要試劑
1,、 丙烯酰胺和N,，N’-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫?zé)?以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g，N,，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g,，加H2O至100ml。)儲于棕色瓶,，4℃避光保存,。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的,。使用期不得超過兩個月,，隔幾個月須重新配制。如有沉淀,，可以過濾,。
2、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS,，1mlH2O去離子水配制,，室溫保存。
3,、 分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合,，加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存,。
4,、 濃縮膠緩沖液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml 1mol/L HCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100ml終體積,。過濾后40C保存,。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備,，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用Tris.CL,。
5,、 TEMED原溶液N，N,，N’N’四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合,。PH太低時，聚合反應(yīng)受到抑制,。10%(w/v)過硫酸胺溶液,。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數(shù)ml,，臨用前配制.
6,、 SDS-PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml,，10%SDS 12.8ml,，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍(lán)1.6ml,，H2O 32ml混勻備用,。按1:1或1:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣,，一般為20-25ul,，總蛋白量100μg。
7,、 Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris,，188g甘氨酸，10gSDS,，用蒸餾水溶解至1000ml,，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋10倍,。
8,、 轉(zhuǎn)移緩沖液：配制1L轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸,、5.8gTris堿,、0.37g SDS，并加入200ml甲醇,，加水至總量1L,。
9、 麗春紅染液儲存液：麗春紅S 2g 三氯乙酸30g 磺基水楊酸 30g 加水至100ml 用時上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄,。
10,、 脫脂奶粉5%(w/v)。
11,、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒,，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS),。
12,、 Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl,。
13,、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14,、 過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體,。
15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺,，75mg/ml),。
16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺,，50mg/ml),。
17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5),。
18、 100mmol/L NaCl,。
19,、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA,。
（可以參看分子克?。?/p>

四、主要步驟
主要包括以下4個基本步驟

1.樣品制備

原始樣品可為細(xì)胞,、組織,、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白,，以下為定性檢測目的蛋白時細(xì)胞樣品的處理方法,，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。

1．培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理,。

2．棄培養(yǎng)基,，用1X PBS漂洗細(xì)胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基,。

3．加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate, 100 μl /w或 75 cm² plate, 500-1000 μl/瓶),，刮落細(xì)胞,，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作,。

4．超聲 10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性,。

5．煮沸樣品5 minutes。

6．離心 12000g, 5 min,，取上清,。

7．電泳分離：上樣15μl~20 μl 至 SDS-PAGE 膠 ( 10 cm x 10 cm)電泳。
如要定量檢測某蛋白的表達(dá)水平,，應(yīng)用RIPA裂解液(1 ml per 10⁷ cells/ 100 mm dish/ 150 cm² flask)裂解細(xì)胞,，收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4～15min,， 14000g離心15min（ 4℃）,，棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測定方法測定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量,，進(jìn)行Western雜交時還需設(shè)置內(nèi)或外參照,，通常用beta-actin。

注意：一般上樣20~30 μg已足夠,，如待檢蛋白為低豐度蛋白,，可加大上樣量至100μg，但電泳條帶易拖尾,，可制備亞細(xì)胞組份或采用更敏感的檢測方法,。

2.電泳分離（參照SDS-PAGE電泳方法）

3.轉(zhuǎn)膜

雜交膜的選擇是決定Western blot成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案,、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素,，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜,。用于Western blot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜(NC) 和PVDF膜,。NC膜是蛋白印跡實(shí)驗的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下,，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起,，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來,。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小,，選擇不同孔徑的NC膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小,，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固,。通常用0.45μm和0.2μm兩種規(guī)格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了,，如用0.45μm的膜就會發(fā)生“Blowthrough”的現(xiàn)象,。PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高,，非常適合于低分子量蛋白的檢測,。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-5秒鐘。

蛋白質(zhì)常用的轉(zhuǎn)移方法主要有兩種：槽式濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)移,。前者操作容易,，轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移,，所用緩沖液少,。以下為槽式濕轉(zhuǎn)的操作步驟。

1.      將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min,。
注意：如檢測小分子蛋白,，可省略此步，因小分子蛋白容易擴(kuò)散出膠,。

2.      依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片,，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。如用PVDF膜需用純甲醇浸泡飽和3-5秒鐘,。

3.      裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿?3層濾紙?膠?膜?3層濾紙?海綿,，每層放好后，用試管趕去氣泡,。切記：膠放于負(fù)極面（黑色面）,。

4.      將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對黑色面）,，加轉(zhuǎn)移緩沖液,，插上電極，100V,，1h（電流約為 0.3A）。注意：應(yīng)再次檢查三明治和電極是否裝配正確,，電源是否接通,。

5.      轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源,，取出雜交膜

4.免疫雜交與顯色

1．用25 ml TBS 洗膜5min,，室溫，搖動,。

2．置膜于25 ml 封閉緩沖液中1h, 室溫,，搖動。

3．15ml TBS/T洗3次（5 min/T）。

4．加入合適稀釋度的一抗,，室溫孵育1-2h或 4°C過夜,，緩慢搖動。

5．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）,。

6．加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的二抗,，室溫孵育1h，緩慢搖動,。

7．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）,。

8．15 ml TBS洗1次。

9．蛋白檢測(顯色法或發(fā)光法,，按相應(yīng)試劑說明操作),。

注意事項：

1．操作中戴手套，不要用手觸膜,。

2．PVDF膜在甲醇中浸泡時間不要超過5秒,。

3．如檢測小于20kD的蛋白應(yīng)用0.2μm的膜，并可省略轉(zhuǎn)移時的平衡步驟,。

4．某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫,，此時可用1.0% BSA代替Tween-20。

5．關(guān)于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用,，掩蓋抗體結(jié)合能力,；0.3~3% BSA in PBS：低的內(nèi)源性交叉反應(yīng)性。

6．如用0. 1% Tween 20,、0.02% NaN ₃ in PBS or TBS作封閉劑和抗體稀釋液,，抗體檢測后可進(jìn)行蛋白染色。

如要同時檢測大分子量和小分子蛋白,，最好用梯度膠分離蛋白,。

五、 實(shí)驗常見的問題指南
根據(jù)問題的類型主要分成以下幾類（以下資料權(quán)作參考,，請勿盲目模仿?。?/p>

1. 參考書推薦

A. 對初學(xué)者看什么資料比較好？
解答：《抗體技術(shù)實(shí)驗指南》和Antibodies（a laboratory manual,， wrote by Ed Harlow ,，david lane）兩本書不錯。

2. 針對樣品的常見問題

B. 做線粒體膜UCP2蛋白的Western Blot （以下簡寫成Western Blot）,，提取線粒體后凍存（未加蛋白酶抑制劑）,，用的博士德的一抗，開始還有點(diǎn)痕跡,，現(xiàn)在越來越差,，上樣量已加到120μg,，換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因,？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎,？
解答：懷疑是樣品問題，可能是：1,，樣品不能反復(fù)凍融,；2，樣品未加蛋白酶抑制劑,。同時,，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗?jié)舛?。對于加蛋白酶抑制劑來說,，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑,。

E. 同一蛋白樣品能同時進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測嗎,？
解答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品,。

F. 如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白,，操作需要注意什么？
解答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白,，所用的去垢劑就要溫和得多,，這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

G. 我的樣品的蛋白含量很低,，每微升不到1微克,，但是在轉(zhuǎn)膜時經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在,，只是顏色變淡了,，有什么辦法可以解決？
解答：你可以加大上樣量,，沒有問題,，還有轉(zhuǎn)移時你可以用減少電流延長時間，多加5－10％甲醇,。

H. 想分離的蛋白是分子量260kd的,，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少,？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎,？
解答：260kd的蛋白不好做,， 分離膠用6％,， Stacking Gel 3.5％,。

I. 如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量,？如果需要加大上樣量使原來弱的條帶能看清楚,。
解答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白,。一般地,，超載30％是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了,，而且小分子量的也要,，可以考慮加大膠的厚度，可以試試 1.5mm的 comb,。

J. 蛋白變性后可以存放多久,？
解答：－ 80℃，一兩年沒有問題,。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉,；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)。

K. 我所測定的蛋白分子量是105KD,，按理說分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%,，但我所查資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何,？
解答：上述您提到的兩種凝膠均可以使用,，因為105ＫＤ的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置,。

L. 接下來我準(zhǔn)備采用DAB顯色技術(shù),，二抗是生物素化的多克隆抗體，三抗是親和素生物素體系,，不知采用這樣的方案后,，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢,？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成,，是嗎？
解答：不能使用脫脂奶粉,，因為脫脂奶粉中含生物素,，用ＢＳＡ代替應(yīng)該好一點(diǎn)．

M. 還有一問題，一般一次上樣的蛋白總量是多少,，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎,？
解答：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度,、上樣量,、一二抗的量和撫育時間都有關(guān)系,，也與顯色時間長短有關(guān)。開始摸條件時,，為了拿到陽性結(jié)果,，各個步驟都可以量多一點(diǎn)時間長一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來了,。要拿到好的結(jié)果,，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了,，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行,。所以拿到好的結(jié)果不容易。

N. 做組織樣品的western的時候,，處理樣品有什么訣竅嗎,？還有，您用過大牛血清做封閉劑嗎,？濃度如何,？效果是不是比BSA好一點(diǎn)？
解答：必須進(jìn)行研磨,、勻漿,、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好,，離心要充分,，膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心),。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng),，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制劑cocktail），封閉劑一般5%脫脂奶粉較常用,。如果一抗為多克隆抗體,，使用ＢＳＡ也是不錯的選擇。

O. 您是否可以介紹一下大分子量蛋白200KD,，在做western要注意什么呢,？
解答：做200kd蛋白的Western Blot時要注意，分離膠最好選擇>7%的,；剝膠時要小心,；轉(zhuǎn)移時間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）,。

P. 有什么方法可以提高上樣量,？
解答：可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量,。

Q. 我要檢測的目的蛋白是分子量大概為42kd的膜蛋白,，膜蛋白提取可不可以不用到超速離心機(jī),，有沒有直接用低溫高速離心機(jī)就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大,？
解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白）,，可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞漿蛋白,，用這個做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速離心機(jī),。42kd 不算大,，也不算小，所以,，可以按照一般的轉(zhuǎn)移方法實(shí)施,。

R. 蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？
解答：上樣量要根據(jù)實(shí)驗的要求來定,， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等,， 如果只是要定性，則沒有太大的關(guān)系,， 盡量多上就行了,， 但是不要超過0.3μg/mm2。

S. 一抗,，二抗的比例是否重要,？
解答：比較重要，調(diào)整好一抗,，二抗的比例,，可以去掉部分非特異的本底。

3. 抗體

T.