蛋白質(zhì)印跡免疫分析（Western Blot Anglysis）

【基本原理】

蛋白質(zhì)印跡免疫分析的過程包括蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳分離后,，在電場(chǎng)作用下將凝膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,，經(jīng)封閉后再用抗待檢蛋白質(zhì)的抗體作為探針與之結(jié)合，經(jīng)洗滌后,，再將濾膜與二級(jí)試劑—放射性標(biāo)記的或辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)抗免疫球蛋白抗體結(jié)合,，進(jìn)一步洗滌后,，通過放射自顯影或原位酶反應(yīng)來確定抗原—抗體—抗抗體復(fù)合物在濾膜上的位置和豐度。

【器材】
轉(zhuǎn)移電泳儀 ,，硝酸纖維素膜,，濾紙，剪刀,，手套,，小尺
 

【試劑】
1．IgG 標(biāo)準(zhǔn)品
2．羊抗人辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IgG 抗體
3．轉(zhuǎn)移buffer：Tris 3.03g，Gly14.4g,，甲醇200ml,，加三蒸水至1000ml充分溶解，4℃冰箱貯存,。
4．Tris buffer（TBS）：Tris 2.42g,，NaCl 29.2g，溶于600ml三蒸水,，再用1N HCl調(diào)至pH7.5,，然后補(bǔ)加三蒸水至1000ml。
5．漂洗液（TTBS）：TBS液500ml,，加Tween20 250ul,。
6．封閉液：5%脫脂奶粉。
7．抗體buffer：1.5g BSA溶于50ml TTBS,。
8．顯色液DAB（3.3-diaminobenzidine,，3.3-二氨基聯(lián)苯胺）配制：5mg DAB溶于10ml 檸檬酸buffer（0.01mol/L 檸檬酸2.6ml，0.02 mol/L Na2HPO4 17.39ml）,，加30% H2O2 10
μl（臨用時(shí)現(xiàn)配）,。
9．脫色液：甲醇250ml，冰醋酸100ml,，加蒸餾水至1000ml,。
10．氨基黑染色液（0.1%氨基黑-10B）：0.2g 氨基黑-10B 溶于200ml 脫色液中，充分?jǐn)嚢枞芙?，濾紙過濾,。
【操作步驟】
一、樣品的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
按實(shí)驗(yàn)四操作步驟進(jìn)行,。加樣時(shí),，注意在同一塊膠上按順序做一份重復(fù)點(diǎn)樣，以備電泳結(jié)束時(shí),，一份用于免疫鑒定,，一份用于蛋白染色顯帶，以利相互對(duì)比,，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
二,、轉(zhuǎn)移印跡
1．轉(zhuǎn)移前準(zhǔn)備：將濾紙，硝酸纖維素膜（NC）剪成與膠同樣大小,，NC膜浸入蒸餾水中10-20min 后浸入轉(zhuǎn)移buffer中平衡30min ,。
2．凝膠平衡：將電泳后的SDS-PAGE膠板置于轉(zhuǎn)移buffer 中平衡30-60min。
3．按圖操作：逐層鋪平,，各層之間勿留有氣泡和皺折,。
4．開始轉(zhuǎn)移，連接正負(fù)極,，蓋好蓋子,，接上電源，恒流0.8mA/cm,，室溫下轉(zhuǎn)移1h,，轉(zhuǎn)移后的凝膠再用氨基黑10B染色液染色20min ，然后脫色檢測(cè)轉(zhuǎn)移效果,。
三,、免疫染色
1．轉(zhuǎn)移后的NC膜于5%脫脂奶粉中封閉，4℃過夜,。
2．TBS洗膜1-2次,，10min/次。
3．加HRP標(biāo)記的抗體,，室溫1h ,。
4．TBS洗3次，10min/次,。
5．NC膜再轉(zhuǎn)入DAB顯色液中,，置暗處反應(yīng)，待顯色反應(yīng)達(dá)到最佳程度時(shí),，立即用三蒸水洗滌終止反應(yīng),。